Browsing by Author "Figueroa Lamas, Carlos Rodrigo"
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Item Actualización y mejoramiento de cepario de laboratorio de fisiología y biología molecular de frutosAutores: Rojas Núñez, BárbaraProfesor Guía: Figueroa Lamas, Carlos RodrigoLa implementación de un cepario en un laboratorio de investigación no suele ser fácil debido a que no existe un conceso a nivel nacional o mundial respecto a cómo éste debería ser organizado, requerimientos de almacenamiento o documentos de trabajo, sólo existiendo guías de diferentes laboratorios, y recomendaciones de entidades administradores de calidad como la ISO, cada una con sus propias metodologías y control de calidad. Al analizar los protocolos provenientes de diferentes laboratorios, así como también las recomendaciones de instituciones oficiales, se realizó un protocolo para este laboratorio en particular ateniéndose a los requerimientos del mismo. El Laboratorio de Fisiología y Biología Molecular de Frutos (FBMF) de la Universidad de Talca cuenta con una amplia variedad de cepas bacterianas de trabajo con inserción de plásmidos realizadas en el lugar, sin embargo, este laboratorio no cuenta con un protocolo de trabajo ni de almacenamiento óptimo. La técnica de almacenamiento más utilizada es la congelación, en donde mediante el uso de criotubos, caldo Luria y criopreservantes tales como glicerol y leche descremada bacteriológica, se logra el correcto almacenamiento de las cepas. Los nuevos registros de las cepas, así como también protocolos de trabajo y registros permiten el trabajo óptimo del laboratorio en relación a las cepas almacenadas, permitiendo que exista una trazabilidad en el trabajo.Item Cambio en expresion genica y actividad enzimatica asociados a modificaciones de la pared celular durante el crecimiento y maduracion de frutos de Fragaria chiloensisAutores: Figueroa Lamas, Carlos RodrigoProfesor Guía: Moya León, AlejandraLa frutilla chilena (Fragaria chiloensis) posee características de calidad de fruto únicas, que la convierten en un producto atractivo para la diversificación de la producción de berries en Chile. El fruto presenta un color blanco, así como un aroma y sabor característico. Sin embargo, la firmeza del fruto, carácter que afecta la calidad vida de postcosecha de los frutos, y por ende, de importancia para un programa de mejoramiento genético de Fragaria, ha sido poco estudiado en F. chiloensis. La idea que el ablandamiento asociado a la maduración de frutos carnosos es una consecuencia directa de la degradación enzimática de la pared celular, ha sido ampliamente estudiada. El objetivo de la presente Tesis es analizar y comparar los cambios en la composición de polímeros de pared celular a medida que transcurren cambios en la firmeza del fruto durante el crecimiento y maduración de la frutilla chilena y frutilla comercial (Fragaria × ananassa cv. Chandler). Del mismo modo, se compara los niveles de expresión génica y actividad enzimática durante el proceso de ablandamiento en ambas especies. Frutos de ambas especies cultivados en el mismo huerto comercial (Contulmo, Región del Biobío, Chile), se clasificaron según tamaño y características morfológicas, y luego se les midió la firmeza. Posteriormente, de cada estadio de desarrollo se extrajo pared celular, y se obtuvo fracciones enriquecidas en pectinas, hemicelulosas y celulosa. Las distintas fracciones se cuantificaron y se determinó el grado de despolimerización de pectinas y hemicelulosas. Por otra parte, en cada especie se estudió el patrón de expresión (mediante Northernblot) y los niveles de actividad enzimática de poligalacturonasa (PG), pectato liasa (PL), pectina metilesterasa (PME), βgalactosidasa (βGal), αarabinofuranosidasa (AFasa), βxilosidasa (βXyl), xilanasa, endoglucanasa (EGasa) y expansina (Exp). Finalmente, esta información se relacionó con los cambios en la pared celular y la evolución de la firmeza del fruto. Los frutos de ambas especies de frutilla fueron clasificadas durante el crecimiento y la maduración en cuatro estadios de acuerdo al tamaño y a la coloración del receptáculo: verde pequeño (VP), verde grande (VG), transición (T) y maduro (M). La clasificación en F. chiloensis incorporó la coloración de los aquenios. En ambas especies se observó una rápida disminución de la firmeza, aunque se observó una mayor reducción en firmeza entre los estadios VG y T en F. chiloensis comparado con F. × ananassa. Entre los mismos estadios, se observó una mayor disminución en el contenido de pectinas unidas covalentemente en F. chiloensis. Además, la actividad PG fue más alta en F. chiloensis en los estadios VG, T y M, lo que produciría una solubilización acelerada de pectinas en F. chiloensis. El nivel de expresión de mRNAs de PL es mayor en F. × ananassa al final de la maduración, lo que produciría una mayor despolimerización de pectinas covalentes en esta especie. El estudio de los niveles de azúcares neutros (AN) durante el desarrollo del fruto reveló un nivel elevado en la fracción péctica soluble en agua en el estadio T de F. chiloensis. Este fenómeno podría tener su origen en la solubilización de pectinas altamente ramificadas. Por otra parte, se observó una leve despolimerización de hemicelulosas en F. chiloensis durante la maduración junto a una elevada expresión de genes como EGasa y expansinas, y a una alta actividad enzimática de EGasa y xilanasa. Los resultados obtenidos permitieron establecer que en F. chiloensis, la rápida solubilización de pectinas no ramificadas (homogalacturonano) y ramificadas (ramnogalacturonanoI) tendría una mayor importancia en el ablandamiento acelerado de fruto que la despolimerización del homogalacturonano. En tanto, la gran despolimerización de pectinas observada en F. × ananassa, pareciera tener lugar al final de la maduración. Existen cuatro genes, relacionados al metabolismo de pared celular de ambas especies, cuya expresión se asocia directamente al ablandamiento del fruto: PG, PL, EGasa y Exp. PG y EGasa se expresan tempranamente en F. chiloensis, favoreciendo la solubilización de pectinas y despolimerización de hemicelulosas, respectivamente. Por otra parte, PL se expresa en un mayor nivel en F. × ananassa colaborando junto a PG en la despolimerización de pectinas covalentes. La alta actividad de PG observada en F. chiloensis durante el estadio VG, indicaría un efecto en la solubilización acelerada de pectinas. La actividad βGal y AFasa, en aumento hacia el final de la maduración, podría estar relacionada a la desglicosilación de las cadenas laterales de las pectinas solubilizadas en F. chiloensis y desde las pectinas covalentes e iónicas en F. × ananassa. A su vez, la actividad EGasa, xilanasa y βXyl en aumento concomitante a la maduración, tendría efecto en la despolimerización de hemicelulosas en F. chiloensis. En definitiva, tanto el metabolismo como la arquitectura de pared celular de los frutos de especies de Fragaria son diferentes durante el crecimiento y maduración de éstos. Los genes analizados en esta investigación pueden ser empleados como marcadores para asistir los programas de mejoramiento genéticos de frutilla.Item Desarrollo de protoplastos de zanahoria Daucus carota L. para su uso en transfección genéticaAutores: Fuentes Álvarez, HarleyProfesor Guía: Figueroa Lamas, Carlos RodrigoEl objetivo del presente trabajo fue desarrollar una línea celular de protoplastos de zanahoria (Daucus carota L.) estable y útil para la transfección genética. Para esto se realizaron cultivos in vitro de semillas, las cuales se hicieron germinar hasta la formación de plántulas, de las cuales se extrajo un segmento que a través de embriogénesis en medio MS suplementados con sacarosa, vitaminas y hormona 2,4 – D fueron transformados en callos. Los callos fueron trozados e inoculados en medio MS en suspensión suplementado con azúcar, vitaminas, hormonas (ANA y kinetina) y se mantuvieron en este medio realizando subcultivos cada 10 días para la mantención de su viabilidad. Los cultivos en suspensión fueron tratados con un complejo de enzimas fúngicas degradadoras de pared celular formando protoplastos, los cuales fueron transfectados a través de electroporación con el gen GUS.Item Descifrando la regulación de la transcripción de genes de la biosíntesis de proantocianidinas (PAs) en Fragaria chiloensis y Fragaria × ananassaAutores: Gómez Parada, Claudia IsabelProfesor Tutor: Herrera Faúndez, Raúl Simón; Figueroa Lamas, Carlos RodrigoLa frutilla nativa chilena, Fragaria chiloensis, es una planta cultivada a pequeña escala en el centro-sur del país y uno de los progenitores ancestrales del híbrido comercial Fragaria × ananassa. Los receptáculos de ambas especies contienen una gran cantidad de flavonoides, principalmente antocianinas y proantocianinas (PAs) que cumplen distintos roles como defensa a herbívoros, aportando astringencia y capacidad antioxidante de frutos. La síntesis PAs está dada por la acción de un set de enzimas estructurales, codificados por genes cuya transcripción es coordinada por los factores de transcripción (FTs) MYB, bHLH, y WD-40, conformando el complejo MBW. Los genes MYBs pueden activar o reprimir la acumulación tanto de antocianinas como PAs. Existe evidencia que los FT MYBs no sólo estarían involucrados en la represión transcripcional de los genes estructurales de las enzimas responsables de la síntesis de antocianinas, sino que, además, estaría participando en la regulación de PAs, ya sea en la activación o represión de la expresión de genes que codifican para enzimas participantes en la síntesis de estos flavonoides en distintas especies del género Fragaria. De acuerdo con esto, se estudió al FT MYB1 como un componente que interactúa con los FTs MYB9 y bHLH3, así como el rol de este en la regulación de la transcripción de PAs en F. chiloensis y F. × ananassa. Se propone a MYB1 como un posible regulador de la transcripción de los genes ANR y LAR en F. chiloensis. Para lo anterior, se realizaron estudios de los promotores de los genes señalados, enfocado principalmente al análisis de los putativos sitios de unión a los FTs y elementos del complejo MBW. Las secuencias promotoras de los genes señalados fueron ensayadas mediante luciferasa dual, permitiendo evidenciar el grado y tipo de interacción que se genera entre MYB1 y los diferentes elementos componentes del complejo MBW en las zonas promotores de ambos genes para las dos especies, además de activación transcripcional de los genes reporteros debido a la interacción en las zonas promotoras. De esta forma, se permitió avanzar en la caracterización del rol que cumple MYB1 en la síntesis de PAs, permitiendo explicar la existencia de diferencias transcripcionales de los genes ANR y LAR entre ambas especies.
