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Item Cambio en expresion genica y actividad enzimatica asociados a modificaciones de la pared celular durante el crecimiento y maduracion de frutos de Fragaria chiloensisAutores: Figueroa Lamas, Carlos RodrigoProfesor Guía: Moya León, AlejandraLa frutilla chilena (Fragaria chiloensis) posee características de calidad de fruto únicas, que la convierten en un producto atractivo para la diversificación de la producción de berries en Chile. El fruto presenta un color blanco, así como un aroma y sabor característico. Sin embargo, la firmeza del fruto, carácter que afecta la calidad vida de postcosecha de los frutos, y por ende, de importancia para un programa de mejoramiento genético de Fragaria, ha sido poco estudiado en F. chiloensis. La idea que el ablandamiento asociado a la maduración de frutos carnosos es una consecuencia directa de la degradación enzimática de la pared celular, ha sido ampliamente estudiada. El objetivo de la presente Tesis es analizar y comparar los cambios en la composición de polímeros de pared celular a medida que transcurren cambios en la firmeza del fruto durante el crecimiento y maduración de la frutilla chilena y frutilla comercial (Fragaria × ananassa cv. Chandler). Del mismo modo, se compara los niveles de expresión génica y actividad enzimática durante el proceso de ablandamiento en ambas especies. Frutos de ambas especies cultivados en el mismo huerto comercial (Contulmo, Región del Biobío, Chile), se clasificaron según tamaño y características morfológicas, y luego se les midió la firmeza. Posteriormente, de cada estadio de desarrollo se extrajo pared celular, y se obtuvo fracciones enriquecidas en pectinas, hemicelulosas y celulosa. Las distintas fracciones se cuantificaron y se determinó el grado de despolimerización de pectinas y hemicelulosas. Por otra parte, en cada especie se estudió el patrón de expresión (mediante Northernblot) y los niveles de actividad enzimática de poligalacturonasa (PG), pectato liasa (PL), pectina metilesterasa (PME), βgalactosidasa (βGal), αarabinofuranosidasa (AFasa), βxilosidasa (βXyl), xilanasa, endoglucanasa (EGasa) y expansina (Exp). Finalmente, esta información se relacionó con los cambios en la pared celular y la evolución de la firmeza del fruto. Los frutos de ambas especies de frutilla fueron clasificadas durante el crecimiento y la maduración en cuatro estadios de acuerdo al tamaño y a la coloración del receptáculo: verde pequeño (VP), verde grande (VG), transición (T) y maduro (M). La clasificación en F. chiloensis incorporó la coloración de los aquenios. En ambas especies se observó una rápida disminución de la firmeza, aunque se observó una mayor reducción en firmeza entre los estadios VG y T en F. chiloensis comparado con F. × ananassa. Entre los mismos estadios, se observó una mayor disminución en el contenido de pectinas unidas covalentemente en F. chiloensis. Además, la actividad PG fue más alta en F. chiloensis en los estadios VG, T y M, lo que produciría una solubilización acelerada de pectinas en F. chiloensis. El nivel de expresión de mRNAs de PL es mayor en F. × ananassa al final de la maduración, lo que produciría una mayor despolimerización de pectinas covalentes en esta especie. El estudio de los niveles de azúcares neutros (AN) durante el desarrollo del fruto reveló un nivel elevado en la fracción péctica soluble en agua en el estadio T de F. chiloensis. Este fenómeno podría tener su origen en la solubilización de pectinas altamente ramificadas. Por otra parte, se observó una leve despolimerización de hemicelulosas en F. chiloensis durante la maduración junto a una elevada expresión de genes como EGasa y expansinas, y a una alta actividad enzimática de EGasa y xilanasa. Los resultados obtenidos permitieron establecer que en F. chiloensis, la rápida solubilización de pectinas no ramificadas (homogalacturonano) y ramificadas (ramnogalacturonanoI) tendría una mayor importancia en el ablandamiento acelerado de fruto que la despolimerización del homogalacturonano. En tanto, la gran despolimerización de pectinas observada en F. × ananassa, pareciera tener lugar al final de la maduración. Existen cuatro genes, relacionados al metabolismo de pared celular de ambas especies, cuya expresión se asocia directamente al ablandamiento del fruto: PG, PL, EGasa y Exp. PG y EGasa se expresan tempranamente en F. chiloensis, favoreciendo la solubilización de pectinas y despolimerización de hemicelulosas, respectivamente. Por otra parte, PL se expresa en un mayor nivel en F. × ananassa colaborando junto a PG en la despolimerización de pectinas covalentes. La alta actividad de PG observada en F. chiloensis durante el estadio VG, indicaría un efecto en la solubilización acelerada de pectinas. La actividad βGal y AFasa, en aumento hacia el final de la maduración, podría estar relacionada a la desglicosilación de las cadenas laterales de las pectinas solubilizadas en F. chiloensis y desde las pectinas covalentes e iónicas en F. × ananassa. A su vez, la actividad EGasa, xilanasa y βXyl en aumento concomitante a la maduración, tendría efecto en la despolimerización de hemicelulosas en F. chiloensis. En definitiva, tanto el metabolismo como la arquitectura de pared celular de los frutos de especies de Fragaria son diferentes durante el crecimiento y maduración de éstos. Los genes analizados en esta investigación pueden ser empleados como marcadores para asistir los programas de mejoramiento genéticos de frutilla.Item Estudio Proteomico de la formacion de madera en Pino Maritimo, Pinus pinasterAutores: Garces Cea, Marcelo ArnoldoProfesor Guía: Herrera Faúndez, RaúlLas propiedades de la madera en pino marítimo varían tanto a nivel químico, anatómico y mecánico. Seis tipos de madera se pueden encontrar al seno de un mismo árbol: madera temprana, madera tardía, madera de copa, madera de base, madera de compresión y madera opuesta. En este trabajo de tesis, hemos testeado la hipótesis según la cual la variabilidad fenotípica de las propiedades de la madera, están liadas a la expresión diferencial de proteínas a través de la xilogénesis. Por una aproximación proteómica, basada en la electroforesis bidimensional y la espectrometría de masas en tándem (LC ESI MS/MS), hemos identificado 165 proteínas diferencialmente exprimidas a lo largo de un gradiente de edad cambial ( madera juvenil y madera madura) y 93 proteínas diferencialmente exprimidas en el curso de una temporada de crecimiento (madera de primavera y madera de verano) en pino marítimo . Un análisis químico complementario se realizo a las muestras por pirolisis analítica. Nuestros resultados mostraron que el xilema secundario formado al inicio de la temporada así Como el formado por un cambium joven presentan una sobre expresión de proteínas que participan en la división celular. En el xilema formado a partir de un cambium maduro o al fin de la temporada hemos descubierto proteínas implicadas en la defensa celular ( su rol seria evitar la muerte celular programada), y proteínas implicadas en la biosíntesis de elementos constitutivos de la pared. Este estudio contribuye a reforzar nuestros conocimientos sobre las actividades moleculares que intervienen durante la xilogénesis. Se descubren por otro lado, pistas de investigación a seguir sobre la detección de genes implicados en el control genético de las propiedades de la madera en un objetivo de selección asistida por marcadores
