3.2.05. Doctorado en Ciencias, Mención Ingeniería Genética Vegetal
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Item ¿Es el compromiso entre floración y activación de la respuesta a estrés hídrico modulado por factores de transcripción DREB, genes de respuesta a auxina y dehidrinas en Colobanthus quitensis?Autores: Galleguillos De La Paz, Carolina IsabelAutor Institucional: Universidad de TalcaProfesor Guía: Molina Montenegro, Marco AntonioLos compromisos, compensaciones o trade-offs (en inglés), en las especies vegetales son estrategias indispensables para la supervivencia, principalmente para especies que habitan en ambientes con condiciones continuamente estresantes. Estos compromisos se basan en la asignación de recursos, cuando existe un factor limitante, por ejemplo, el agua. El agua en las plantas es requerida para procesos importantes en la historia de vida de los organismos vegetales, como lo es fotosíntesis, transporte de nutrientes y transporte de fotosintatos, entre otros. Por lo tanto, si el agua es limitada, el recurso disponible se asignará a la mantención de estructuras vegetativas y procesos vitales, en desmedro del crecimiento y formación de nuevos órganos. Una de las compensaciones más estudiadas en las plantas, es la que se da cuando las plantas dejan de crecer para ocupar sus recursos en la activación de rutas que encienden el sistema de defensa. Este compromiso ha sido extensamente estudiado, e incluso se conoce el regulador molecular del mecanismo que subyace a este fenómeno, el cual es el factor de transcripción HBI1, sin embargo, de otros trade-offs hay muy poca información a este nivel. Antártica posee unos de los climas más hostiles del planeta, bajas temperaturas, fuertes vientos y escasas precipitaciones propician que haya baja disponibilidad hídrica para la flora, incluso algunos autores coinciden en que el agua es el principal recurso limitante para la biota terrestre. Colobanthus quitensis Kunth (Bartl) es una especie vascular, cariophyllaceae, nativa de Antártica, a la cual se le llama de manera coloquial clavelito antártico. Habita desde los 17° latitud N, hasta los 68° latitud S. Esta especie, al igual que otras que habitan en áreas con climas extremos, han desarrollado estrategias a niveles fisiológicos, bioquímicos y moleculares para su supervivencia. En este estudio se comprobó la existencia de un trade-off o compensación, entre estrés hídrico y floración en Colobanthus quitensis en poblaciones provenientes de Antártica (Isla Rey Jorge, Islas Shetland del Sur, Bahía Paraíso e Isla Lagotellerie) y una proveniente del extremo sur de Sudamérica (Punta Arenas). Individuos de las poblaciones mencionadas fueron sometidos a condiciones de sequía, condiciones de cambio climático proyectado y aplicación exógena de auxina, para luego determinar a través de parámetros fisiológicos, bioquímicos y análisis moleculares, los niveles de estrés y tolerancia que presentaban. A nivel molecular, se observó que esta compensación es modulada por genes de respuesta a estrés hídrico (CqCOR47) y de represores transcripcionales de la respuesta a auxina (CqIAA12). Adicionalmente, se sugiere que el gen CqDREB2A, que codifica para factores de transcripción de respuesta a sequía, podría ser un regulador de este trade-off. Finalmente, se determinó que, en las poblaciones estudiadas de Colobanthus quitensis al simular un escenario de cambio climático, aumentando la disponibilidad de agua, la población más sensible a este cambio a nivel molecular es la proveniente del sitio más austral (Isla Lagotellerie) y que el compromiso establecido entre tolerancia a estrés hídrico y desarrollo de estructuras reproductivas se termina.Item Descifrando la regulación de la transcripción de genes de la biosíntesis de proantocianidinas (PAs) en Fragaria chiloensis y Fragaria × ananassaAutores: Gómez Parada, Claudia IsabelAutor Institucional: Universidad de TalcaProfesor Tutor: Herrera Faúndez, Raúl; Figueroa Lamas, CarlosLa frutilla nativa chilena, Fragaria chiloensis, es una planta cultivada a pequeña escala en el centro-sur del país y uno de los progenitores ancestrales del híbrido comercial Fragaria × ananassa. Los receptáculos de ambas especies contienen una gran cantidad de flavonoides, principalmente antocianinas y proantocianinas (PAs) que cumplen distintos roles como defensa a herbívoros, aportando astringencia y capacidad antioxidante de frutos. La síntesis PAs está dada por la acción de un set de enzimas estructurales, codificados por genes cuya transcripción es coordinada por los factores de transcripción (FTs) MYB, bHLH, y WD-40, conformando el complejo MBW. Los genes MYBs pueden activar o reprimir la acumulación tanto de antocianinas como PAs. Existe evidencia que los FT MYBs no sólo estarían involucrados en la represión transcripcional de los genes estructurales de las enzimas responsables de la síntesis de antocianinas, sino que, además, estaría participando en la regulación de PAs, ya sea en la activación o represión de la expresión de genes que codifican para enzimas participantes en la síntesis de estos flavonoides en distintas especies del género Fragaria. De acuerdo con esto, se estudió al FT MYB1 como un componente que interactúa con los FTs MYB9 y bHLH3, así como el rol de este en la regulación de la transcripción de PAs en F. chiloensis y F. × ananassa. Se propone a MYB1 como un posible regulador de la transcripción de los genes ANR y LAR en F. chiloensis. Para lo anterior, se realizaron estudios de los promotores de los genes señalados, enfocado principalmente al análisis de los putativos sitios de unión a los FTs y elementos del complejo MBW. Las secuencias promotoras de los genes señalados fueron ensayadas mediante luciferasa dual, permitiendo evidenciar el grado y tipo de interacción que se genera entre MYB1 y los diferentes elementos componentes del complejo MBW en las zonas promotores de ambos genes para las dos especies, además de activación transcripcional de los genes reporteros debido a la interacción en las zonas promotoras. De esta forma, se permitió avanzar en la caracterización del rol que cumple MYB1 en la síntesis de PAs, permitiendo explicar la existencia de diferencias transcripcionales de los genes ANR y LAR entre ambas especies.Item Estudio del efecto de la sobreexpresión conjunta de los genes que codifican para una Rab GTPasa de la vía endocítica y una GDP dissociation inhibitor (GDI) en raíces de Arabidopsis thaliana en el tráfico vesicular intracelular, la acumulación de sodio en las vacuolas y en la tolerancia al estrés salinoAutores: Soto salazar, Flavia LeticiaAutor Institucional: Universidad de TalcaProfesor Guía: Ruiz Lara, SimónLas plantas bajo estrés ambiental activan diferentes mecanismos para restablecer la homeostasis y para proteger y reparar las proteínas y membranas dañadas. Esto requiere la eliminación de moléculas existentes de varios compartimentos celulares y el reemplazo de éstos por unos nuevos. Este reciclaje y eliminación de macromoléculas se lleva a cabo mediante un complejo sistema de tráfico de vesículas intracelulares que está regulado por Rab GTPasas. Para llevar a cabo su acción, las Rab GTPasas ciclan entre el estado inactivo unido a GDP y activo unido a GTP. En este ciclo otras proteínas accesorias están involucradas, las cuales son GDI, GAP y GEF. Las proteínas GDI son responsables del reciclaje de Rab GTPasas una vez ocurrida la hidrólisis de GTP, asociándose a las Rab GTPasas libres en la espera de iniciar un nuevo ciclo. Se ha estudiado la implicación de Rab GTPasas en el estrés salino, relacionando la sobreexpresión de estos genes con la tolerancia a la salinidad en plantas. Además, se ha demostrado que la sobreexpresión de SchGDI1 en Arabidopsis thaliana confiere tolerancia a la salinidad. Considerando que las Rab GTPasas requieren una proteína GDI para realizar el ciclo durante el proceso de tráfico de membranas, en esta tesis se propone que la expresión conjunta de ambos genes en raíces de plantas de Arabidopsis thaliana genera una mayor tolerancia al estrés salino que aquellas plantas que expresen estos genes individualmente, lo cual estará asociado a un incremento del tráfico vesicular y a una mayor acumulación de sodio en las vacuolas. Para ello se seleccionó una de las Rab GTPasas de Solanum chilense que esté involucrada en la vía endocítica y cuyo gen se induce bajo condiciones de estrés, SchRabG3e. Este gen junto a SchGDI1 fueron expresados ectópicamente en raíces de Arabidopsis thaliana y estas plantas fueron sometidas a diferentes concentraciones de NaCl. Posterior a esto se evaluaron distintos parámetros fisiológicos y fenotípicos asociados a estrés salino. Junto a esto, se determinó el efecto de la expresión conjunta y separada de estos genes en la aceleración de la endocitosis y el contenido de sodio en vacuolas, comparando las plantas de Arabidopsis thaliana que expresan estos genes por separado y conjuntamente. Se observa un efecto sinérgico en aquellas plantas doble transgénicas, teniendo mayores largos de raíz y peso fresco en condiciones estresantes. Junto a esto se observó un tráfico vesicular acelerado y mayor acumulación de sodio en vacuola, que les permite tolerar de forma más eficiente el estrés salino al que son sometidas.Item ¿Es el compromiso entre floración y activación de la respuesta a estrés hídrico modulado por factores de transcripción DREB, genes de respuesta a auxina y dehidrinas en Colobanthus quitensis?Autores: Galleguillos de la Paz, Carolina IsabelAutor Institucional: Universidad de TalcaProfesor Guía: Molina Montenegro, Marco AntonioLos compromisos, compensaciones o trade-offs (en inglés), en las especies vegetales son estrategias indispensables para la supervivencia, principalmente para especies que habitan en ambientes con condiciones continuamente estresantes. Estos compromisos se basan en la asignación de recursos, cuando existe un factor limitante, por ejemplo, el agua. El agua en las plantas es requerida para procesos importantes en la historia de vida de los organismos vegetales, como lo es fotosíntesis, transporte de nutrientes y transporte de fotosintatos, entre otros. Por lo tanto, si el agua es limitada, el recurso disponible se asignará a la mantención de estructuras vegetativas y procesos vitales, en desmedro del crecimiento y formación de nuevos órganos. Una de las compensaciones más estudiadas en las plantas, es la que se da cuando las plantas dejan de crecer para ocupar sus recursos en la activación de rutas que encienden el sistema de defensa. Este compromiso ha sido extensamente estudiado, e incluso se conoce el regulador molecular del mecanismo que subyace a este fenómeno, el cual es el factor de transcripción HBI1, sin embargo, de otros trade-offs hay muy poca información a este nivel. Antártica posee unos de los climas más hostiles del planeta, bajas temperaturas, fuertes vientos y escasas precipitaciones propician que haya baja disponibilidad hídrica para la flora, incluso algunos autores coinciden en que el agua es el principal recurso limitante para la biota terrestre. Colobanthus quitensis Kunth (Bartl) es una especie vascular, cariophyllaceae, nativa de Antártica, a la cual se le llama de manera coloquial clavelito antártico. Habita desde los 17° latitud N, hasta los 68° latitud S. Esta especie, al igual que otras que habitan en áreas con climas extremos, han desarrollado estrategias a niveles fisiológicos, bioquímicos y moleculares para su supervivencia. En este estudio se comprobó la existencia de un trade-off o compensación, entre estrés hídrico y floración en Colobanthus quitensis en poblaciones provenientes de Antártica (Isla Rey Jorge, Islas Shetland del Sur, Bahía Paraíso e Isla Lagotellerie) y una proveniente del extremo sur de Sudamérica (Punta Arenas). Individuos de las poblaciones mencionadas fueron sometidos a condiciones de sequía, condiciones de cambio climático proyectado y aplicación exógena de auxina, para luego determinar a través de parámetros fisiológicos, bioquímicos y análisis moleculares, los niveles de estrés y tolerancia que presentaban. A nivel molecular, se observó que esta compensación es modulada por genes de respuesta a estrés hídrico (CqCOR47) y de represores transcripcionales de la respuesta a auxina (CqIAA12). Adicionalmente, se sugiere que el gen CqDREB2A, que codifica para factores de transcripción de respuesta a sequía, podría ser un regulador de este trade-off. Finalmente, se determinó que, en las poblaciones estudiadas de Colobanthus quitensis al simular un escenario de cambio climático, aumentando la disponibilidad de agua, la población más sensible a este cambio a nivel molecular es la proveniente del sitio más austral (Isla Lagotellerie) y que el compromiso establecido entre tolerancia a estrés hídrico y desarrollo de estructuras reproductivas se termina.Item Descifrando la regulación de la transcripción de genes de la biosíntesis de proantocianidinas (PAs) en Fragaria chiloensis y Fragaria × ananassaAutores: Gómez Parada, Claudia IsabelAutor Institucional: Universidad de TalcaProfesor Tutor: Herrera Faúndez, Raúl; Figueroa Lamas, CarlosLa frutilla nativa chilena, Fragaria chiloensis, es una planta cultivada a pequeña escala en el centro-sur del país y uno de los progenitores ancestrales del híbrido comercial Fragaria × ananassa. Los receptáculos de ambas especies contienen una gran cantidad de flavonoides, principalmente antocianinas y proantocianinas (PAs) que cumplen distintos roles como defensa a herbívoros, aportando astringencia y capacidad antioxidante de frutos. La síntesis PAs está dada por la acción de un set de enzimas estructurales, codificados por genes cuya transcripción es coordinada por los factores de transcripción (FTs) MYB, bHLH, y WD-40, conformando el complejo MBW. Los genes MYBs pueden activar o reprimir la acumulación tanto de antocianinas como PAs. Existe evidencia que los FT MYBs no sólo estarían involucrados en la represión transcripcional de los genes estructurales de las enzimas responsables de la síntesis de antocianinas, sino que, además, estaría participando en la regulación de PAs, ya sea en la activación o represión de la expresión de genes que codifican para enzimas participantes en la síntesis de estos flavonoides en distintas especies del género Fragaria. De acuerdo con esto, se estudió al FT MYB1 como un componente que interactúa con los FTs MYB9 y bHLH3, así como el rol de este en la regulación de la transcripción de PAs en F. chiloensis y F. × ananassa. Se propone a MYB1 como un posible regulador de la transcripción de los genes ANR y LAR en F. chiloensis. Para lo anterior, se realizaron estudios de los promotores de los genes señalados, enfocado principalmente al análisis de los putativos sitios de unión a los FTs y elementos del complejo MBW. Las secuencias promotoras de los genes señalados fueron ensayadas mediante luciferasa dual, permitiendo evidenciar el grado y tipo de interacción que se genera entre MYB1 y los diferentes elementos componentes del complejo MBW en las zonas promotores de ambos genes para las dos especies, además de activación transcripcional de los genes reporteros debido a la interacción en las zonas promotoras. De esta forma, se permitió avanzar en la caracterización del rol que cumple MYB1 en la síntesis de PAs, permitiendo explicar la existencia de diferencias transcripcionales de los genes ANR y LAR entre ambas especies.Item Evaluación de la capacidad de un gen SNARE-like involucrado en tráfico vesicular, para modular la tolerancia a estrés salino en Solanum lycopersicumAutores: Salinas Cornejo, Josselyn AndreaAutor Institucional: Universidad de TalcaProfesor Guía: Ruiz Lara, SimónEl tráfico vesicular intracelular asegura el intercambio de lípidos y proteínas entre los compartimentos membranosos. Bajo estrés salino esto cobra gran importancia, ya que tanto la remoción de transportadores y canales iónicos de la membrana plasmática como la compartimentación de los iones tóxicos requiere de la formación de vesículas, que pueden ser mantenidos como cuerpos multivesiculares, o bien, ser fusionados a la vacuola central. Uno de los componentes participantes incluye a la familia de proteínas SNAREs (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment receptor), que actúan en el proceso de fusión de vesículas, otorgándole especificidad al destino final de éstas. Es por ello que las SNAREs son un blanco interesante de investigación que permitiría entender el rol que tienen éstas durante el estrés salino en plantas. Las evidencias descritas hasta la fecha en Arabidopsis thaliana muestran que la sobreexpresión de determinados SNAREs conducen a un aumento de la tolerancia al estrés salino. Este efecto podría ser consecuencia de un aumento en la acumulación de sodio en la vacuola o que ocurra una compartimentación de especies reactivas de oxígeno en cuerpos multivesiculares, evitando con ello la alcalinización y pérdida de viabilidad de la vacuola. Por otra parte, el análisis de los genomas de plantas ha revelado una superfamilia de genes que codifican para proteínas denominadas SNARE-like, que al igual que las anteriores parecen estar participando en el tráfico vesicular con funciones semejantes. La participación de estas proteínas durante el estrés abiótico es prácticamente desconocida, a excepción de los estudios recientemente descritos con la sobreexpresión en tabaco de un gen SNARE-like de la planta halófita Salicornia brachiata, que es capaz de otorgar tolerancia a múltiples tipos de estrés abiótico, incluyendo el estrés salino. Los estudios de la participación de SNARE-like en plantas de importancia económica, como tomate son desconocidos. Por lo anterior, en esta tesis se propuso estudiar los efectos de la sobreexpresión de un gen SNARE-like, denominado SlSLSP6, en plantas de Solanum lycopersicum sometidas a condiciones de alta salinidad. Se realizó una búsqueda de putativos genes homólogos al SNARE-like de S. brachiata en el genoma de S. lycopersicum, identificándose aquellos que tienen expresión diferencial bajo estrés salino y se seleccionó aquel que mostró una mejor respuesta, tanto en hojas como en raíces. El análisis in silico de SlSLSP6 permitió la predicción de un dominio Longin-like, que la categorizó como una SNARE-like. Además, mediante análisis filogenético se determinó una relación de SlSLSP6 con proteínas SNARE-like de S. brachiata, Zostera marina y Solanum pennelli, plantas tolerantes a la salinidad. Junto con esto, se predijo un putativo dominio de un complejo adaptador de clatrinas y un sitio de palmitoilación. La localización subcelular indicó que SlSLSP6 se ubica en la membrana plasmática, manifestando su posible participación en la endocitosis. Los efectos de la sobreexpresión de SlSLSP6 en plantas de tomate frente a estrés salino fueron evidentes al observarse una mejora de los parámetros fisiológicos y bioquímicos, tales como un mayor contenido de clorofila, índice de rendimiento, eficiencia del fotosistema II y contenido relativo de agua, y un menor contenido de MDA, mejorando la tolerancia de estas plantas bajo estrés salino. La sobreexpresión de SlSLSP6 también aumentó la tasa endocítica, aumentando el tráfico vesicular. Además, se observó una disminución en la acumulación de especies reactivas de oxígeno, lo que se correlacionaría con el aumento de la compartimentación del sodio en las vacuolas de células de raíces de tomate. Estos resultados contribuyen a comprender el rol de esta proteína SNARE-like durante el estrés salino. Se espera que esta investigación sirva de base para el uso de estos genes en programas de mejoramiento genético de la tolerancia a estrés salino en tomate. // ABSTRACT: Intracellular vesicular traffic ensures the exchange of lipids and proteins between the membranous compartments. Under saline stress, this becomes very important, since both the removal of transporters and ion channels from the plasma membrane and the compartmentalization of toxic ions require the formation of vesicles, which can be maintained as multivesicular bodies, or be fused to the central vacuole. One of the participating components includes the family of genes encoding SNARE (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment receptor) proteins, which act in the vesicle fusion process, giving specificity to their destination. For this reason, SNAREs are an interesting research target that would allow us to understand the role they have during saline stress in plants. The evidence described to date in Arabidopsis thaliana shows that the overexpression of certain SNAREs leads to an increase in tolerance to salt stress. This effect could be the consequence of an increase in the accumulation of sodium in the vacuole or that a compartmentalization of reactive oxygen species occurs in multivesicular bodies, thereby avoiding alkalization and loss of viability of the vacuole. On the other hand, the analysis of plant genomes has revealed a superfamily of proteins called SNARE-like, which, like SNAREs, seem to be participating in vesicular trafficking with similar functions. The participation of these proteins during abiotic stress is practically unknown, except for the recently described studies with the overexpression in tobacco of a SNARE-like gene from the halophytic plant Salicornia brachiata, which is capable of granting tolerance to multiple types of abiotic stress, including salt stress. Studies of the participation of SNARE-like in plants of economic importance, such as tomato are unknown. Therefore, in this work it was proposed to study the effects of the overexpression of a SNARE-like gene, called SlSLSP6, in Solanum lycopersicum plants subjected to high salinity conditions. A search was carried out for putative genes homologous to the SNARE-like of S. brachiata in the genome of S. lycopersicum, identifying those that have differential expression under saline stress and the one that showed a better response, both in leaves and roots, was selected. The in-silico analysis of SlSLSP6 allowed the prediction of a Longin-like domain, which categorized it as a SNARE-like. In addition, by phylogenetic analysis, a relationship of SlSLSP6 with SNARE-like proteins from S. brachiata, Zostera marina and Solanum pennelli, salinity- tolerant plants, was determined. Along with this, a putative domain of a clathrin adapter complex and a palmitoylation site were predicted. The subcellular location indicated that SlSLSP6 is in the plasma membrane, showing its possible participation in endocytosis. The effects of SlSLSP6 overexpression in tomato plants against saline stress were evident when an improvement in physiological and biochemical parameters was observed, such as a higher chlorophyll content and performance index, higher photosystem II efficiency and relative water content and a lower content of MDA, improving the tolerance of these plants under saline stress. SlSLSP6 overexpression also increased the endocytic rate, increasing vesicular traffic. In addition, a decrease in the accumulation of reactive oxygen species was observed, which would correlate with the increase in sodium compartmentation in the vacuoles of tomato roots cells. These results contribute to understanding the role of this SNARE-like protein during salt stress. It is expected that this research will serve as the basis for the use of these genes in programs for the genetic improvement of tolerance to salt stress in tomato.Item Estudio de los efectos ejercidos por la expresión y coexpresión radicular de genes MON1 y CCZ1 de Solanum chilense sobre la respuesta a estrés salino de Arabidopsis thaliana y su capacidad para compartimentar Na+ en vacuolasAutores: Madrid Espinoza, José AntonioAutor Institucional: Universidad de TalcaProfesor Guía: Ruiz Lara, SimónPara evitar el efecto detrimental del estrés salino, las plantas son capaces de reducir las concentraciones citoplasmáticas de Na+ mediante el incremento de su compartimentación en la vacuola. Para lograrlo, un activo y eficiente mecanismo de transporte de vesículas, provenientes desde la Red Trans-Golgi o endosoma temprano, moviliza proteínas y membranas que se fusionarán con el tonoplasto y permitirán el secuestro de los iones. Recientemente, se estableció que este proceso requiere del intercambio entre miembros de la familia de RabGTPasas RabF y RabG, el cual es regulado por el complejo heterodimérico MON1/CCZ1. La proteína MON1 actúa como efector de RabF, dirigiendo la fusión de vesículas con el endosoma tardío, mientras que el complejo MON1/CCZ1 actúa como una proteína con actividad GEF (Intercambiadora del Nucleótido de Guanina) activando a RabG y permitiendo la fusión de vesículas provenientes desde el endosoma tardío con la vacuola. En Arabidopsis thaliana, la familia MON1 está compuesto de un solo miembro, mientras que la familia CCZ1 posee dos (CCZ1a y CCZ1b). La ausencia de cualquiera de ambas proteínas involucradas en el complejo causa enanismo y retardo en el desarrollo, evidenciando su importancia para el desarrollo vegetal. Por otra parte, las familias RabF y RabG están formadas por tres y ocho miembros, respectivamente, y todos son blancos de MON1/CCZ1. Entre ellas se destacan RabF1 y RabG3e, que ha sido involucradas en la tolerancia a estrés salino de A. thaliana, al incrementar la tasa endocítica, y la capacidad de compartimentar Na+ en la vacuola, sugiriendo fuertemente el potencial rol del complejo GEF en estos mecanismos. A partir de genes obtenidos de especies vegetales halófitas, diversas investigaciones señalan que los mecanismos de endocitosis y el tráfico vesicular pre-vacuolar tendría un rol fundamental en la capacidad de tolerancia a estrés salino. De igual manera, mediante herramientas biotecnológicas, se ha demostrado que esta capacidad puede ser transferida a especies de interés comercial especialmente sensibles a estrés abiótico. En ese contexto, Solanum chilense, una especie de tomate silvestre tolerante a sequía y salinidad, evidenció poseer genes homólogos a los de MON1 y CCZ1 de A. thaliana, ambos denominados SchMON1 y SchCCZ1, y con capacidad para complementar funcionalmente las líneas mutantes de A. thaliana mon1-1 y ccz1a/b. Adicionalmente, la fuerte y coordinada expresión de ambos genes, en raíces y hojas de plantas de S. chilense sometidas a estrés salino, sugirió el involucramiento del complejo y la vía de tráfico pre-vacuolar en la capacidad de tolerancia de esta especie. Para confirmarlo, análisis experimentales de expresión y co-expresión heteróloga de SchMON1 y SchCCZ1, utilizando un promotor específico para raíces, evidenciaron incrementar la tolerancia a estrés salino de A. thaliana de forma diferencial. Entre los tres genotipos obtenidos, la expresión radicular de SchMON1 otorgó mayor tolerancia a estrés salino, debido a una mayor tasa endocítica en sus células radiculares, tanto en condiciones normales como en estrés. Adicionalmente, se reveló la presencia de grandes estructuras endosomales que podrían estar asociadas a esta mejorada capacidad para tolerar el estrés en este genotipo. El rol modulador que posee el tráfico pre-vacuolar durante estrés abiótico ha sido recientemente investigado en otros ámbitos, como el control hormonal, el movimiento vesicular de especies reactivas de oxígeno y la autofagia. En tal contexto, los tres genotipos transgénicos analizados evidenciaron reducir la expresión de genes involucrados en la vía de señalización por ABA cuando eran sometidos a estrés salino, sugiriendo la activación de la vía independiente a esta hormona. Esto fue confirmado con la reducción de la sensibilidad frente a la aplicación de ABA exógeno. Conjuntamente, se redujo del contenido de H2O2 en raíces, lo cual fue coherente con activación transcripcional de genes involucrados en mecanismos enzimáticos de detoxificación, como AtSOD1 y AtAPX, y además al verse contenido en endosomas. Adicionalmente, la reducción en la expresión de los genes de respuesta a estrés oxidativo en tejido aéreo sugirió un menor efecto del estrés salino en los genotipos tolerantes. Por otra parte, resultó evidente el incremento en la actividad autofágica en los tres genotipos, lo cual es coherente con una mayor capacidad de la vacuola para compartimentar el Na+. Esto fue confirmado mediante el incremento en la intensidad de la fluorescencia del indicador de Na+, Sodium-Green, y la correlación positiva con la inducción transcripcional del gen AtNHX1. Todos estos resultados permiten concluir que SchMON1 y SchCCZ1 de S. chilense tienen la capacidad de participar del intercambio Rab5-Rab7 y del tráfico pre-vacuolar en A. thaliana; y que la expresión o co-expresión radicular de ambos genes incrementa diferencial y significativamente el grado de tolerancia a estrés salino de A. thaliana, de una manera independiente de ABA, vía la reducción del estrés oxidativo, el incremento de la actividad autofágica, y una capacidad superior para compartimentar Na+ de sus vacuolas, mecanismos potencialmente transferibles a especies agrícolas de interés económico. // ABSTRACT: To avoid the detrimental effect of salt stress, plants reduce cytoplasmic Na+ concentrations by increasing its compartmentalization in the vacuole. To achieve this, an active and efficient vesicle transport mechanism, coming from the Trans-Golgi Network or early endosome, mobilizes proteins and membranes that will fuse with the tonoplast and allow the sequestration of ions. Recently, it was established that this process requires the conversion between members of the RabGTPase family RabF and RabG, which is regulated by the MON1/CCZ1 heterodimeric complex. The MON1 protein acts as an effector of RabF, directing the fusion of vesicles with the late endosome, while the MON1/CCZ1 complex acts as a protein with GEF activity (Guanine Nucleotide Exchanger) activating RabG and allowing the fusion of vesicles from late endosome with the vacuole. In Arabidopsis thaliana, the MON1 family has only one member, while the CCZ1 family has two (CCZ1a and CCZ1b). The absence of either of the two proteins involved in the complex causes dwarfism and developmental delay, evidencing the importance of both in plant development. On the other hand, the RabF and RabG families have three and eight members, respectively, and all are MON1 / CCZ1 targets. Among them, RabF1 and RabG3e have been involved in the tolerance to saline stress of A. thaliana, by increasing the endocytic rate, and the capacity to compartmentalize Na+ in the vacuole, which strongly suggests a potential role of the GEF complex in these mechanisms. From genes obtained from halophytic plant species, various investigations indicate that endocytosis mechanisms and pre-vacuolar vesicular traffic would play a fundamental role in the capacity for tolerance to salt stress. Similarly, using biotechnological tools, it has been shown that this capacity can be transferred to species of commercial interest that are especially sensitive to abiotic stress. In this context, Solanum chilense, a species of wild tomato tolerant to drought and salinity, showed homologous genes to those of MON1 and CCZ1 of A. thaliana, both named SchMON1 and SchCCZ1, and with the capacity to functionally complement mutant lines of A. thaliana mon1-1 and ccz1a/b. Additionally, the strong and coordinated expression of both genes, in roots and leaves of S. chilense plants subjected to saline stress, suggested the involvement of the complex and the pre-vacuolar traffic pathway in the tolerance capacity of this species. To confirm this, experimental analysis of heterologous expression and co-expression of SchMON1 and SchCCZ1, using a specific promoter for roots, showed the differential increase of the tolerance to saline stress of A. thaliana. Among the three genotypes obtained, the radicular expression of SchMON1 granted greater tolerance to saline stress, due to a higher endocytic rate in its root cells, both under normal and stress conditions. Additionally, the presence of large endosomal structures that could be associated with this improved ability to tolerate stress in this genotype was revealed. The modulatory role of pre-vacuolar traffic during abiotic stress has recently been investigated in other areas, such as hormonal control, the vesicular movement of reactive oxygen species, and autophagy. In this context, the three transgenic genotypes showed a reduction in the expression of genes involved in the ABA signaling pathway when they were subjected to salt stress, suggesting the activation of the pathway independent of this hormone. This was confirmed with the enhance insensitivity to exogenous ABA. Together, the H2O2 content was reduced in roots, which was consistent with the transcriptional activation of genes involved in enzymatic detoxification mechanisms, such as AtSOD1 and AtAPX, and also with their compartmentalization in endosomes. Additionally, the reduction in gene expression related to oxidative stress response in air tissue suggested a lower effect of salt stress in tolerant genotypes. On the other hand, the increase in autophagic activity was evident in the three genotypes, which is consistent with a greater capacity of the vacuole to compartmentalize Na+. This was confirmed by the increase in the intensity of the fluorescence of the Na+ indicator, Sodium-Green, and the positive correlation with the transcriptional induction of the AtNHX1 gene. All these results allow us to conclude that SchMON1 and SchCCZ1 from S. chilense have the ability to participate in the conversion of Rab5-Rab7 and pre-vacuolar trafficking in A. thaliana; and that the radicular expression or co-expression of both genes increases the degree of tolerance to saline stress of A. thaliana, in an ABA-independent way, via the reduction of oxidative stress, the increase of autophagic activity, and a superior capacity to compartmentalize Na+ into its vacuoles, mechanisms potentially transferable to agricultural species of economic interest.Item Alteración en la expresión de genes que codifican proteínas de Arabinogalactano (AGPS) de Arabidopsis thaliana por el factor de transcripción mads-10 de Pinus radiata D. DonAutores: Méndez Castro, Tamara IvonneAutor Institucional: Universidad de TalcaProfesor Guía: Herrera Faúndez, SimónPinus radiata es una especie leñosa, ampliamente distribuida en Chile, con una gran adaptabilidad a distintas condiciones ambientales, sin embargo, el establecimiento de plantaciones en laderas o zonas afectas por fuertes vientos, promueve la pérdida de verticalidad del tallo, generando un crecimiento excéntrico del tronco. Ello constituye un problema importante para la industria forestal. Plántulas de pino de un año han sido inclinadas con un ángulo de 45°. En la zona inferior del tronco se ha reportado la expresión diferencial del factor de transcripción PrMADS10, lo cual ocurre a tiempos tempranos de inclinación. Al sobrexpresar este PrMADS10 en Arabidopsis, bajo el control del promotor CaMV::35S, fue posible observar cambios significativos en la expresión de genes que podrían estar modulados por este factor de transcripción. Un grupo de estos genes se relacionan a modificaciones de pared celular (EXPA8-EXT3), como es el control de los ángulos de las fibrillas de celulosa (FLA11), la adhesión, proteínas altamente glicosiladas denominadas hydroxyproline-rich glycoproteins (HRGPs), donde estan clasificadas las proteinas de arabinogalactano (AGPs) y dentro de estas fasciclin-like con dominio FAS que les otorga adhesión celular. Los resultados mostraron una alta significancia, considerándose aquellos que presentaron un p-value <0.05 y algunos factores de transcripción como MAP70.5 y genes que están involucrados en respuesta a estrés como es deficiencia de fosfato. Para esto se solicitó líneas de Arabidopsis que tuviesen inserto T-DNA, se genotipó y se realizó cortes histológicos con tinciones para observar si esto se relaciona a la acumulación de lignina, comparado con tinción de floroglucinol en líneas 35S. En plantas leñosas como álamo y eucaliptus, se ha reportado una mayor concentración de AGPs en madera de tensión que es análoga a la de compresión en gimnospermas. A su vez, se caracterizó mutantes de AtFLA11 en Arabidopsis, observando resistencia a tracción en tallo. Se presume que este tipo de proteína de arabinogalactano pueda estar involucrada en la remodelación de la pared en pino y facilite la recuperación del crecimiento normal del tallo. Con estos antecedentes se propone la siguiente hipótesis: “El factor de transcripción MADS10 de Pinus radiata D. Don altera diferencialmente la expresión y cantidad de proteínas de arabinogalactanos (AGPs) en Arabidopsis thaliana”. Para someter a prueba esta hipótesis, se evaluó el efecto de inducir la expresión de PrMADS10 en un sistema heterólogo como es Arabidopsis thaliana, considerando al menos cuatro líneas sobrexpresoras, que se analizaron mediante microarreglo, a partir de esto se buscaron elementos en cis in silico en la zona promotora de los genes candidatos. Se cuantificó la concentracion de AGPs totales en muestras de líneas sobreexpresadas versus el control, a su vez se indagó la búsqueda de secuencias de fasciclin-like en datos de pino de 11 a más años versus datos de RNA-seq de pino al ser inclinado a 45°, encontrando al menos 12 secuencias completas, las que fueron clasificadas por filogenia. Esta propuesta espera dar luces sobre el rol que PrMADS10 podría jugar en la respuesta a pérdida de verticalidad. // ABSTRACT: Pinus radiata is a woody species, widely distributed in Chile, with great adaptability to different environmental conditions, however, the establishment of plantations on slopes or areas affected by strong winds, promotes the loss of verticality of the stem, generating an eccentric growth of the trunk. This is a major problem for the forestry industry. One year old pine seedlings have been tilted at a 45° angle. Differential expression of the transcription factor PrMADS10 has been reported in the lower part of the trunk, which occurs at early times of inclination. By overexpressing PrMADS10 in Arabidopsis, under the control of the CaMV::35S promoter, significant changes in the expression of genes that could be modulated by this transcription factor was observed. A group of these genes are related to cell wall modifications (EXPA8-EXT3), such as those that control cellulose fibrils angles (FLA11); adhesion, highly glycosylated proteins called hydroxyproline-rich glycoproteins (HRGPs). Within this group of proteins Arabinogalactan proteins (AGPs) were found, which are classified and within them fasciclin-like with FAS domain gives the propierty of cell adhesion. Results showed significant differences for a group of genes. Transcription factors such as MAP70.5 and genes involved in response to stress such as phosphate starvation were those that presented a p value <0.05. Arabidopsis lines that had a T-DNA insert were requested from seeds libraries. The plants were genotyped and histological sections were made to observe changes in the cell wall, correlating the accumulation of lignin, compared with floroglucinol to Arabidopsis PrMADS10::35S lines. In woody plants such as poplar and eucalyptus, a higher concentration of AGPs have been reported in tension wood, analogous to what is observed in gymnosperms as compression wood. In turn, AtFLA11 mutants have been characterized in Arabidopsis, observing stem tensile strength. It is presumed that this type of arabinogalactan protein may be involved in cell Wall remodeling in pine and facilitate the recovery of normal stem growth. Based on this background, the following hypothesis is proposed: "The MADS10 transcription factor from Pinus radiata D. Don differentially alters the expression and quantity of arabinogalactan proteins (AGPs) in Arabidopsis thaliana." To test this hypothesis, the effect of inducing the expression of PrMADS10 in a heterologous system such as Arabidopsis thaliana was evaluated, considering at least four over-expressing lines, which were analyzed by microarray, also cis elements were searched in silico in the promoter region of candidate genes. The concentration of total AGPs was quantify in overexpressed lines compared to control, in turn, fasciclin-like sequences in pine were searched from 11 years old tree and compared to the RNA-seq data obtained when pine was inclined at 45°. Twelve complete fascilin sequences were found, which were phylogeny classified. This proposal gives light on the role that PrMADS10 could play in response to loss of verticality.Item Identificación y caracterización de factores de transcripción del tipo C2H2-ZFP involucrados en el desarrollo del polen de Vitis viniferaAutores: Arrey Salas, Oscar AndrésProfesor: Ruiz Lara, SimónAutor Institucional: Universidad de TalcaProfesor Guía: González Villanueva, EnriqueEn la vid (Vitis vinifera L.) se ha sugerido que malformaciones generadas en el desarrollo del polen, reduce el potencial de germinación y la entrega de células espermáticas a los óvulos, aumentando la incidencia del desarrollo de frutos partenocárpicos (DFP), con un impacto negativo en la calidad del vino. Los mecanismos reguladores que controlan la formación de polen siguen siendo desconocidos en la vid. Sin embargo, en otras plantas se ha revelado una red que involucra varios tipos de factores de transcripción través del modelo (A)B(C) del desarrollo floral y se han asignado roles clave a los miembros de la familia de proteínas con dedos de zinc del tipo C2H2 (ZFP). Factores de este tipo han sido asociados a la regulación del desarrollo del polen en petunia, arabidopsis, y otras especies. El silenciamiento de algunos de estos genes provoca alteraciones morfológicas y funcionales en los granos de polen, en las diferentes etapas del desarrollo de estos. La identificación en el genoma de la vid tanto de genes homólogos a aquellos que regulan el desarrollo de anteras y polen en Arabidopsis thaliana, así como genes homólogos a la familia EPF de petunia, permite sugerir que los mecanismos moleculares similares a los descritos en estas especies modelo, regulan el desarrollo del polen en la vid. Basado en ello se planteó como hipótesis de trabajo: “La regulación del desarrollo del polen involucra la participación de proteínas factores de transcripción del tipo C2H2-ZFP en Vitis vinifera L.” Para comprender mejor el papel de las ZFP en el desarrollo del polen se realizó una búsqueda de genoma amplio identificando un grupo de 98 genes que codifican para ZFP (familia VviZFP), ampliamente distribuidos en el genoma de la vid. Luego de una caracterización general, se seleccionó un grupo de genes VviZFPs presumiblemente implicados en el desarrollo del polen, de acuerdo con su perfil de expresión in silico y homología con ZFP que regulan el desarrollo del polen, informado en otras plantas modelo. Posteriormente, se posicionaron eventos del desarrollo del polen dentro de la escala del desarrollo floral/frutal en vid (Sistema E-L), con análisis de microscopía y de expresión relativa de genes relacionados en el cultivar ‘Carmenere’. En este cultivar, la especificación de células madre del polen es visible a partir del estadio E-L13 y el desarrollo del polen ocurre entre el estadio E-L13 y E-L16. Luego, se determinó la expresión temporal de un set de genes VviZFP candidatos durante un periodo de la segunda temporada del desarrollo floral de la vid, se identificaron elementos de respuesta en las regiones promotoras de estos genes (2000 pb desde el codón de inicio de la transcripción) y finalmente se determinó la actividad órgano específica de la región promotora de VviZFP11 y VviZFP67. Todos los genes VviZFP seleccionados mostraron dinámicas de expresión a lo largo del desarrollo floral, lo que sugiere una posible participación de estos en el desarrollo de la vid. Las regiones promotoras presentaron diferentes niveles de enriquecimiento con elementos reguladores cis de respuesta a factores de transcripción, de señalización hormonal y elementos de expresión específicos del polen. Se observaron diferencias en la actividad espacio/temporal de los promotores entre VviZFP68 y el ortólogo propuesto PhMEZ1, sugiriendo roles diferentes para ambos genes. Por otro lado, el promotor del gen VviZFP13 presenta actividad similar a lo observado en AtDAZ1/2, además de actividad específica en tejido estigmático, haciéndolo interesante para estudios posteriores. Sin embargo, los perfiles de expresión indican que estos genes están siendo transcritos durante el momento del desarrollo del polen en vid. Finalmente, los resultados generados en esta tesis permiten generar una fuente de información importante que será útil a la hora de desarrollar trabajos posteriores que persigan comprender la participación de un grupo reducido de VviZFPs en eventos del desarrollo del polen en la vid. // ABSTRACT: In grapevine (Vitis vinifera L.) it has been suggested that malformations generated in the development of pollen, reduces the potential for germination and the delivery of sperm cells to the ovules, increasing the incidence of parthenocarpic fruit development (DFP), with an impact negative on the wine quality. The regulatory mechanisms that control pollen formation remains unknown in grapevine. However, in other plants a network involving various types of transcription factors has been revealed through the (A)B(C) model of flower development and key roles have been assigned to members of the C2H2 type zinc finger protein family (ZFP). Factors of this type have been associated with the regulation of pollen development in petunia, arabidopsis, and other species. The silencing of some of these genes causes morphological and functional alterations in pollen grains, at different stages of their development. The identification in the grapevine genome of genes homologous to those that regulate the development of anthers and pollen in Arabidopsis thaliana as well as genes homologous to the EPF family of petunia, allows us to suggest, that molecular mechanisms similar to those described in these model species regulate the pollen development in grapevine. Based on this, it is proposed as a working hypothesis: "The regulation of pollen development involves the participation of C2H2-ZFP-type transcription factor proteins in Vitis vinifera L." To better understand the role of ZFPs in pollen development, a genome-wide search was carried out identifying a group of 98 genes that code for ZFP (VviZFP family), widely distributed in the grapevine genome. After a general characterization, a group of VviZFPs genes presumably involved in pollen development was selected according to their in silico expression profile and homology with ZFP that regulate pollen development reported in other model plants. Subsequently, pollen development events were positioned within the scale of floral/fruit development in grapevine (E-L System), with microscopy analysis and relative expression of related genes in the ‘Carmenere’ cultivar. In this cultivar, the pollen stem cell specification is visible from stage E-L13 and pollen development occurs between stage E-L13 and E-L16. Then, the temporal expression of a set of candidate VviZFP genes were determined during a period of the second season of floral development in grapevines, response elements were identified in the promoter regions of these genes (2000 bp from the start codon) and finally the specific activity of the promoter region of VviZFP11 and VviZFP67 were determined. All the VviZFP genes showed these expression dynamics throughout flower development, suggesting a possible participation in grapevine development. The promoter regions present different levels of enrichment with cis regulatory elements of response to transcription factors, hormonal signaling, and pollen-specific expression elements. Differences in the spatial/temporal activity of the promoters are observed between VviZFP68 and the proposed PhMEZ1 ortholog, suggesting different roles for both genes. On the other hand, the promoter of the VviZFP13 gene presents activity similar to that observed in AtDAZ1/2, in addition to specific activity in stigmatic tissue, making it interesting for subsequent studies. However, the expression profiles indicate that these genes are being transcribed during the time of pollen development in grapevine. Finally, the results generated in this thesis allow generating an important source of information that will be useful when developing subsequent works that seek to understand the participation of a small group of VviZFPs in grapevine pollen development events.Item Determinantes genéticos del crecimiento y calidad de la madera de Eucalyptus cladocalyx: un enfoque de haplotipo y asociación de genoma completoAutores: Valenzuela Pinto, Camilo EduardoAutor Institucional: Universidad de TalcaProfesor Guía: Mora Poblete, FreddyLa productividad agrícola y forestal de los ecosistemas mediterráneos está siendo fuertemente amenazada por los efectos adversos del cambio climático, en los cuales se incluye el aumento de las sequías severas y cambios en la distribución de las precipitaciones. En la presente tesis, se llevó a cabo un estudio de asociación de genoma amplio (GWAS) para identificar polimorfismos nucleotídicos (SNPs) y bloques de haplotipos asociados con el crecimiento y la calidad de la madera de Eucalyptus cladocalyx; una especie arbórea adecuada para ambientes de baja precipitación. El estudio se realizó en un ensayo de progenie-procedencia establecido en un sitio de clima árido de tendencia mediterránea, localizado al sur del desierto de Atacama, Chile. Se aisló ADN desde tejido de hojas de 480 individuos (~10 individuos por familia; de un total de 49 familias de medios hermanos), los cuales posteriormente se genotiparon usando un arreglo de 60 mil SNPs. El genotipaje produjo 3.879 SNPs y 108 bloques de haplotipos. Se encontraron correlaciones fenotípicas significativas entre altura-diámetro, altura-densidad de la madera, y diámetro-densidad de la madera, con una significativa variación entre procedencias. Un total de 87 SNPs, y 3 bloques de haplotipos se asociaron significativamente con caracteres de crecimiento (altura, diámetro a la altura del pecho, y coeficiente de esbeltez) y calidad de la madera (altura de bifurcación, rectitud del fuste y densidad de la madera). Además, mediante una regresión Bayesiana multivariada, se identificaron 11 loci en común entre los caracteres de altura, diámetro y densidad de la madera. En general, los análisis revelaron que las asociaciones marcador-característica se localizaron a menos de 3,2 kb de distancia (y dentro) de genes relacionados principalmente con el metabolismo primario, transporte y biosíntesis de pared secundaria. Adicionalmente, se detectaron asociaciones que coincidieron con genes de respuesta a estrés, tales como GEM-related 5 y Prohibitin-3. Los hallazgos aquí presentados proporcionan genes candidatos que podrían estar involucrados en el control genético de características morfológicas que se relacionan con la adaptación de árboles de Eucalyptus a ambientes áridos. // ABSTRACT: The agricultural and forestry productivity of Mediterranean ecosystems is being strongly threatened by the adverse effects of climate change, including an increase in severe droughts and changes in rainfall distribution. In the present study, we performed a genome-wide association study (GWAS) to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs) and haplotype blocks associated with the growth and wood quality of Eucalyptus cladocalyx, a tree species suitable for low-rainfall sites. The study was conducted in a progeny-provenance trial established in an arid site with Mediterranean patterns located in the southern Atacama Desert, Chile. A total of 87 SNPs and 3 haplotype blocks were significantly associated with growth traits (total height, diameter at breast height, and slenderness coefficient) and stem quality traits (first bifurcation height, stem straightness, and wood density). In addition, eleven loci were identified to be jointly associated between height, diameter and wood density through Bayesian multivariate regression. In general, the GWAS revealed associations with genes related to primary metabolism and biosynthesis of cell wall components. Additionally, associations coinciding with stress response genes, such as GEM-related 5 and prohibitin-3, were detected. The findings of this study provide valuable information regarding genetic control of morphological traits related to adaptation of eucalyptus trees to arid environments.Item Evaluación del rol funcional del gen VviPSZ3 en el desarrollo reproductivo de Vitis vinífera L. cv. Carménère. Análisis mediante complementación del mutante zat4 de Arabidopsis thalianaAutores: Puentes Romero, Ana CarolinaProfesor: Ruiz Lara, SimónAutor Institucional: Universidad de TalcaProfesor Guía: González Villanueva, EnriqueVitis vinifera L. es un importante cultivo frutal a nivel mundial. Por esta razón, es esencial comprender el desarrollo reproductivo de esta especie. Sin embargo, en la actualidad se tiene escaso conocimiento sobre su control genético. Algunos cultivares de vides, como Carménère, presentan alta incidencia en el desarrollo de frutos partenocárpicos, los cuales se forman sin el proceso de doble fecundación, por consiguiente, no presentan semillas, permaneciendo pequeños y verdes hasta la maduración. El polen desempeña un papel fundamental en la fertilidad de la planta, a través de la entrega de los gametos masculinos al saco embrionario, para que ocurra la doble fecundación. En especies modelos, se han descrito factores de transcripción del tipo C2H2 zinc-finger (C2H2-ZF) involucrados en diferentes estadios del desarrollo y maduración del polen. En la vid, VviPSZ3 es un C2H2-ZF que estaría involucrado en el desarrollo del polen y semillas. En este trabajo, se posicionó a VviPSZ3 en la red regulatoria del desarrollo de polen y semillas. Primero, se determinó el patrón temporal del desarrollo floral y del polen en la vid, posicionando el desarrollo del polen entre los estadios 13 y 15 del sistema E-L. Con estos antecedentes, se determinó que VviPSZ3 se expresa tardíamente en el desarrollo de anteras y polen. Luego, se expresó VviPSZ3 en el genotipo mutante de Atzat4, un putativo ortólogo en Arabidopsis thaliana. Se caracterizó fenotípicamente el mutante Atzat4 (+/-), como putativo ortólogo de VviPSZ3, observándose defectos en la línea germinal masculina, mostrando defectos en la germinación y elongación del tubo polínico. Además, Atzat4 (+/-) presentó una reducida fertilidad, con un menor número de semillas por silicua, las cuales, además, mostraron una reducida viabilidad y germinación; de igual manera mostró un tamaño de silicua menor al compararse con el WT. La expresión de VviPSZ3 en Atzat4 restableció el fenotipo silvestre, mostrando corrección de los defectos en el desarrollo del polen y semillas, previamente caracterizados en el mutante, sugiriendo que ambos factores de transcripción son ortólogos. Finalmente, se identificaron putativos genes blanco de VviPSZ3, en plantas transgénicas de A. thaliana, los cuales estarían involucrados en procesos del desarrollo y maduración del grano de polen, fundamentalmente, durante la formación de la pared y la cubierta del polen; además, durante el proceso de polinización y doble fecundación. Asimismo, se identificaron genes blancos de VviPSZ3, que participan en el desarrollo del embrión y las semillas. Con estos resultados, se puede concluir que VviPSZ3 estaría involucrado en procesos reproductivos de V. vinifera cv. Carménère, asociado al desarrollo del polen y semillas. // ABSTRACT: Vitis vinifera L. is an important fruit crop worldwide. For this reason, it is essential to understand its reproductive development. However, currently there is little knowledge about its genetic control. Some grapevine cultivars, such as cv. Carménère, have a high incidence in the development of parthenocarpic fruits, which forms without the double fertilization process, and consequently, do not present seeds, remaining small and green until maturation. Pollen plays a fundamental role in plant fertility, through the delivery of male gametes to the embryo sac, to double fertilization occurs. In model species, C2H2-type zinc-finger transcription factors (C2H2-ZF) have been involved in different pollen development and maturation stages. In grapevine, VviPSZ3 is a C2H2-ZF that would be involved in pollen and seeds development. In this work, VviPSZ3 was positioned in the pollen and seed development regulatory network. First, the flower and pollen development timing on the grapevine, was determined, positioning pollen development between stages 13 and 15, in the E-L system. With this background, it was determined that VviPSZ3 was expressed late in the anther and pollen development. Then, VviPSZ3 was introduced in the mutant genotype of Atzat4, a putative ortholog in Arabidopsis thaliana. The mutant Atzat4 (+/-) was characterized phenotypically, as a putative orthologue of VviPSZ3, observing defects in the male germline, and showing defects in the pollen tube germination and elongation. Furthermore, Atzat4 (+/-) presented reduced fertility, with a lower number of seeds per silique, which also, showed reduced viability and germination. It also exhibited a smaller silique size than the WT. The expression of VviPSZ3 in Atzat4 restored the wild phenotype corrected the defects in pollen and seeds development, previously characterized in the mutant, suggesting that both transcription factors are orthologous. Finally, VviPSZ3 target genes were identified in A. thaliana transgenic plants, which would be involved in processes of pollen grain development and maturation, fundamentally, during the pollen wall and coat formation; moreover, during pollination and double fertilization process. Besides VviPSZ3 target genes were identified, involved in the embryo and seeds development. With these results, it is concluded that VviPSZ3 would be involved in V. vinifera cv. Carménère reproductive processes, related to pollen and seed development.Item Mapeo asociativo de genoma completo (GWAS) para el ángulo foliar, altura de la planta y altura de la primera mazorca en líneas endogámicas de maíz (Zea mays L.)Autores: Maldonado Muñoz, Carlos ErnestoProfesor Guía: Mora Poblete, FreddyLas características relacionadas con la arquitectura de las plantas, incluyendo su capacidad de mantenerse erguidas frente a condiciones de cultivo, son determinantes de la productividad de las plantas en los sistemas de cultivo intensivo de maíz. En este sentido, los estudios de asociación de genoma amplio (GWAS) basados en polimorfismos de nucleótido único (SNP) han proporcionado información valiosa sobre la relación entre la variación de regiones genéticas y fenotipos complejos como los de la arquitectura. Sin embargo, no existen antecedentes, a la fecha, que relacionen caracteres complejos con haplotipos de genoma amplio en maíz. En el presente estudio se caracterizaron aproximadamente 7,800 bloques haplotipos de un conjunto de SNP de alta calidad (~38,000), en un panel de asociación compuesto por líneas endogámicas de maíz tropical. Con ello, se identificaron asociaciones genómicas con el ángulo de la hoja (AF), altura de la planta (AP), altura de la primera mazorca (AM) y la relación AM/AP. La proporción de la variación fenotípica explicada por los SNP individuales varió entre 7%, para el SNP S1_285330124 (ubicado en el cromosoma 9 y asociado con la relación AM/AP), y 22%, para el SNP S1_317085830 (ubicado en el cromosoma 6 y asociado con el ángulo de la hoja). Un total de 40 bloques de haplotipos se asociaron significativamente con las características de interés, explicando hasta el 29% de la variación fenotípica para el ángulo de la hoja, correspondiente al haplotipo hapAF4.04, que se mantuvo estable durante dos temporadas de crecimiento. En general, las asociaciones para AP, AM y la relación AM/AP fueron específicas de la temporada, lo que se confirmó mediante un análisis de comparación de modelos utilizando los criterios de información de Akaike y Schwarz. Además, se identificaron cinco haplotipos estables (83%) y 15 SNP (75%) para el ángulo de la hoja. Otro importante resultado fue que el 29% (4/14) de los loci asociados concomitantemente con AP y AM presentaron una moderada o fuerte evidencia de asociación (log10(Factor Bayes)>3 y Probabilidad posteriori de Asociación>0.5) a estas características en conjunto, proporcionando una clara evidencia de que estos loci tienen un efecto pleiotrópico significativo. Aproximadamente el 62% de las asociaciones con haplotipos (25/40) no contenían SNP detectados en el estudio de asociación utilizando SNP individuales. Este resultado confirma la ventaja de los estudios de asociación de todo el genoma basados en haplotipos para examinar determinantes genéticos que controlan la arquitectura y el encamado de las plantas de maíz. Adicionalmente, el mapeo asociativo basado en haplotipos proporcionó una reducción de la dimensionalidad basada en la agrupación de SNP a partir del patrón de Desequilibrio de Ligamiento (LD) observado en la población, además aumenta la posibilidad de encontrar segmentos genómicos que controlen la variación de una característica. // ABSTRACT: The traits related to the architecture of the plants, including their ability to remain upright in the face of growing conditions, are determinants of the productivity of the plants in the intensive maize cultivation systems. In this sense, Genome-Wide Association Studies (GWAS) based on Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) have provided valuable information on the relationship between the variation of genetic regions and complex phenotypes such as those of architecture. However, to date, there is no background, that relates complex traits to haplotypes of genome-wide in maize. In the present study, approximately 7,800 haplotype blocks of a set of high-quality SNPs (~38,000) were characterized in an association panel composed of inbred lines of tropical maize. With this, genomic associations were identified with the leaf angle (AF), plant height (AP), ear height (AM) and the AM/AP ratio. The proportion of phenotypic variation explained by individual SNPs varied between 7%, for SNP S1_285330124 (located on chromosome 9 and associated with the AM/AP ratio), and 22%, for SNP S1_317085830 (located on chromosome 6 and associated with the leaf angle). A total of 40 haplotype blocks were significantly associated with the traits of interest, explaining up to 29% of the phenotypic variation for the leaf angle, corresponding to the hapAF4.04 haplotype, which remained stable for two growing seasons. In general, the associations for AP, AM and the AM/AP ratio were season-specific, which was confirmed by a model comparison analysis using the information criteria of Akaike and Schwarz. Also, five stable haplotypes (83%) and 15 SNPs (75%) were identified for the leaf angle. Another important result was that 29% (4/14) of the loci associated concomitantly with AP and AM presented moderate or strong evidence of association (log10 (Bayes Factor)> 3 and Posterior Probability of Association> 0.5) to these traits in together, providing clear evidence that these loci have a significant pleiotropic effect. Approximately 62% of the associations with haplotypes (25/40) did not contain SNPs detected in the association study using individual SNPs. This result confirms the advantage of haplotype-based genome-wide association studies to examine genetic determinants that control the architecture and lodging of maize plants. Additionally, haplotype-based association mapping provided a reduction of the dimensionality based on the SNP clustering through on the linkage disequilibrium (LD) pattern observed in the population, also increases the possibility of finding genomic segments that control the variation of traits.Item Evaluación de la participación de RabGDI1 de Solanum chilense en el tráfico vesicular y en la tolerancia al estrés salino en Arabidopsis thalianaAutores: San Martín Davison, Álex DavidAutor Institucional: Universidad de TalcaProfesor Guía: Ruiz Lara, SimónBajo situaciones de estrés las plantas desarrollan estrategias que le permiten incrementar sus niveles basales de tolerancia. Algunas de las estrategias identificadas contemplan la activación de genes implicados en las vías de tráfico vesicular, este argumento encuentra sustento en investigaciones que demuestran un aumento en las dinámicas endocíticas cuando las plantas se someten a estrés salino. Adicionalmente se ha comprobado que la expresión constitutiva de algunos genes del tráfico vesicular en plantas modelo mostraron resultados satisfactorios en el incremento de la tolerancia a la salinidad. Investigaciones preliminares en la especie de tomate silvestre Solanum chilense (Dunal) Reiche, tolerante a la salinidad, han permitido la identificación de un transcrito que es inducido en respuesta al estrés salino. Análisis informáticos revelaron que la secuencia nucleotídica de este transcrito poseía un alto grado de identidad con el gen que codifica para la proteína del inhibidor de la disociación de GDP (GDI), del tipo Rab-GDI y debido a su homología con el gen de Arabidopsis (AtGDI1), se denominó Solanum chilense RabGDI1 (SchRabGDI1). La funcionalidad de esta proteína se relaciona con los procesos de tráfico vesicular, permitiendo la extracción de las RabGTPasas desde la membrana de destino y luego manteniéndolas solubles en el citoplasma, como una reserva, para un próximo movimiento de vesículas. Para desarrollar esta investigación se propusieron los siguientes objetivos; (1) determinar el perfil transcripcional órgano específico de SchRabGDI1 y durante el estrés salino, (2) identificar las características estructurales y filogenéticas de la proteína codificada por SchRabGDI1. (3) determinación de la identidad funcional del producto génico de SchRabGDI1. (4) determinar la capacidad de interacción de SchRabGDI1 y una RabGTPasa involucrada en el tráfico de membranas entre el endosoma y la vacuola. (5) determinar el efecto de la expresión heteróloga de SchRabGDI1 sobre los parámetros fisiológicos en plantas transgénicas de A. thaliana durante el estrés salino. Adicionalmente, se (6) determino el efecto de la expresión heteróloga de este gen sobre la endocitosis en condiciones no estresantes y sobre la (7) distribución intracelular del sodio en raíces de plantas de A. thaliana control y heterólogas para SchRabGDI1 durante el estrés salino. Nuestros resultados muestran que SchRabGDI1 tiene un mayor nivel de acumulación de transcritos en tejido radicular y que comparte las características filogenéticas y los dominios estructurales característicos presente en este grupo de proteínas. Además, la complementación de la levadura mutante sec19-1 con SchRabGDI1 permitió corregir el fenotipo termosensible, demostrando la actividad funcional de SchRabGDI1. Mediante los estudios de BiFC se logró comprobar que SchRabGDI1 es capaz de interactuar in-vivo con una RabGTPasa clave de la ruta endosoma-vacuola. Adicionalmente, la sobreexpresión de SchRabGDI1 evidencio una mejora en parámetros fisiológicos como, la disminución en la acumulación de especies reactivas de oxígeno (EROs), mayor peso fresco de las plántulas, lo cual estaba acompañado de un aumento en la tasa de endocitosis y un aumento en el contenido de Na+ en sus vacuolas comparado a lo exhibido por las plantas silvestres, bajo las mismas condiciones de estrés salino. Este trabajo aporta nuevas evidencias acerca del papel del tráfico vesicular intracelular, y su participación durante el estrés salino, en relación con la expresión heteróloga de SchRabGDI1 en la planta modelo Arabidopsis thaliana. // ABSTRACT: Under stress situations, plants develop strategies which allow them to increase their basal tolerance levels. Some strategies include the activation of genes involved in the vesicular traffic routes. This argument is supported by researches that show an increase in vesicular dynamics when plants are subjected to salt stress. Additionally, it has been proved that the constitutive expression of some vesicular trafficking genes in model plants showed satisfactory results in the increasing of salt tolerance. Previous researches (of our team) on the wild tomato species Solanum chilense (Dunal) Reiche, high tolerant to salinity, have permitted the identification of a transcript which it is induced in response to salt stress. Databases analysis revealed that the nucleotide sequence of this transcript had a high identity degree with the gene that codifies for a GDP dissociation inhibitor (GDI) protein, of Rab-GDI type and due to its homology with the gene of Arabidopsis (AtGDI1), it was named SchRabGDI1.The functionality of this codified protein is related to the vesicular trafficking processes, allowing the RabGTPases extraction from the target membrane and afterwards keeping them soluble in cytoplasm, like a reservory, for a future vesicles movement. To carry out this research, following objectives were set: (1) to determinate organspecific transcriptional profile and (2) to identify the structural and phylogenetic characteristics of the codified protein by SChRabGDI1. (3) to determine the functional identity of SchRabGDI1 gene product. (4) to determinate the in vivo interaction capacity of SchRabGDI1 and a RabGTPase involved in membrane trafficking between the endosome and the vacuole. (5) to determine the variation of physiological parameters in SchRabGDI1 A. thaliana heterologous plants during salt stress. In adition it was (6) determined the effect of heterologous expression of this gene on endocytosis under non-stressful conditions and on the (7) intracellular distribution of sodium in roots of A. thaliana control and SchRabGDI1 heterologous plants during salt stress Our results show that SchRabGDI1 has a higher-level accumulation of transcripts in root tissue and it shares the phylogenetic characteristics and characteristic structural domains present in this group of proteins. Furthermore, the complementation of mutant yeast sec19- 1 strain with SchRabGDI1 allowed to correct the thermosensitive phenotype, demonstrating the functional activity of SchRabGDI1. Due to the BiFC studies, it was possible to verify that SchRabGDI1 can interact in-vivo with a SchRabGTPasa, key protein of the endosome-vacuole pathway. Additionally, the overexpression of SchRabGDI1 showed an improvement in physiological parameters such as the decrease in the accumulation of reactive oxygen species (O2-), higher seedlings fresh weight together with an increase in the endocytosis rate and increase in the of Na+ content in its vacuoles compared to what control plants exhibited under the same conditions of salt stress. This research provides with new evidence about the role of intracellular vesicular trafficking, as well as its participation during saline stress, in relation to the heterologous expression of SchRabGDI1 in the Arabidopsis thaliana model plant.Item Predicción genómica basada en LOCI en desequilibrio de ligamiento, en dos especies de eucalyptus que difieren en su historial de selección y estructura genéticaAutores: Ballesta Muñoz, Paulina AndreaAutor Institucional: Universidad de TalcaProfesor Guía: Mora Poblete, FreddyLas especies del género Eucalyptus L’Hér son económicamente relevantes en el contexto nacional y mundial, las cuales han sido mejoradas genéticamente para diferentes características en diversos ambientes. Los avances en las técnicas de secuenciación de genomas han posibilitado la identificación de diversos factores genéticos que determinan la variación fenotípica de diferentes características económicamente relevantes, los cuales son utilizados en selección asistida por marcadores moleculares (MAS) y en la selección genómica (GS) en diferentes especies de Eucalyptus. La eficacia de los modelos predictivos de GS ha sido variable entre diferentes poblaciones de mejoramiento, dependiendo de la naturaleza de la característica estudiada. Por ejemplo, en características relacionadas al crecimiento de los árboles, el poder predictivo de los modelos genómicos ha sido relativamente moderado, a pesar de contar con una alta densidad de marcadores (>10000 polimorfismos de nucleótido único; SNPs). En términos generales, la precisión de los modelos de GS depende de los supuestos analíticos de los modelos predictivos, aspectos intrínsecos de las poblaciones (por ejemplo, diversidad y estructura genética), y de la arquitectura genética de los rasgos que se desean predecir. En este sentido, diversos estudios han sido realizados con el objetivo de aumentar el poder predictivo en características complejas. En cultivos agrícolas, por ejemplo, se ha observado que la GS basada en loci en desequilibrio de ligamiento (bloques de haplotipos) podría mejorar la precisión de los métodos de predicción genómica en características de baja heredabilidad en sentido amplio. Por otra parte, no existen estudios que aborden el enfoque de haplotipos en la predicción de rasgos complejos de árboles forestales. En base a lo descrito anteriormente, el presente trabajo tuvo como objetivo determinar regiones genómicas en desequilibrio de ligamiento y su influencia en la predicción genómica de caracteres poligénicos en dos especies de Eucalyptus (E. globulus y E. cladocalyx) que difieren en su historial de selección y estructura genética. Para ello, en una primera etapa, se estudió la tasa de transferencia de marcadores SNPs en ambas especies, usando un arreglo de ADN de alta densidad (60K), desarrollado en E. grandis y en otras especies del género. La transferibilidad de los marcadores SNP fue mayor en E. globulus (~14000 SNPs) que en E. cladocalyx (~3800 SNPs), lo cual puede ser explicado por el hecho de que E. cladocalyx pertenece a una sección genéticamente distante de las secciones de Eucalyptus utilizadas en el desarrollo del arreglo de SNP. Consecuentemente, un menor número de bloques de haplotipos fueron identificados en la población de E. cladocalyx (~108) que en la población de E. globulus (~1137). En características de baja heredabilidad (h2<0,1), los bloques de haplotipos mejoraron el poder predictivo, y estimaron mayores valores de heredabilidad (genómica) comparado con las estimaciones basadas en pedigrí. Por otro lado, los modelos GS tuvieron una mejor respuesta en E. globulus. En este sentido, la baja densidad de marcadores encontrada en E. cladocalyx podría haber influido en estos resultados. Para mejorar la predicción genómica en esta especie, se propuso un enfoque de predicción que combina los modelos de GS con el mapeo de loci de características cuantitativas (QTLs) y los antecedentes de estructura genética de la población (genealogía). Se concluye que el enfoque de haplotipos podría ser especialmente beneficioso para predecir características de baja heredabilidad de Eucalyptus, en un escenario donde la base genética ha sido reducida debido a la intensidad de selección. Por otro lado, en poblaciones que no poseen un historial de selección artificial, el uso combinado de los antecedentes de estructura genética y la información genómica contribuyen a una mejor predicción fenotípica. Los hallazgos de este estudio contribuyen a optimizar el proceso de selección de árboles en la industria forestal basada en Eucalyptus. // ABSTRACT: Eucalyptus are economically important species in the local and worldwide context, which have been genetically improved for different traits under several environmental conditions. Advances in genome sequencing techniques have allowed to identify several genetic factors explaining the phenotypic variation of different economic traits. Currently, molecular markers (MM) are used in genomic selection (GS) to predict the breeding value of an individual. Different Eucalyptus spp. have been studied with the principles of GS. The efficacy of the GS models has been variable among different breeding populations, depending strongly on the genetic architecture of the studied trait. For instance, the ability of GS models to predict growth-related traits has been relatively moderate, despite having a high density of markers (> 10,000 single nucleotide polymorphisms; SNPs). In general, the accuracy of GS depends on: the analytical assumptions of the prediction models, marker density, linkage disequilibrium pattern, intrinsic features of the populations (instance, diversity and genetic structure), and the genetic architecture of the target traits. In this sense, several studies have been carried out for increasing the predictive ability in complex traits. In crops, it has been reported that GS based on loci in linkage disequilibrium (haplotype blocks) could improve the accuracy of GS methods, due to these genomic regions have a greater ability to predict low heritable traits than SNPs. On the other hand, there are not studies that address the haplotype approach in the prediction of complex traits of forest trees. Based on this information, the aim of the present study was to identify genomic regions in linkage disequilibrium (LD) and their influence on the genomic prediction of polygenic traits in two Eucalyptus spp. (E. globulus and E. cladocalyx) that differ in their selection history and genetic structure. For this, the transferability of SNPs markers from a high-density DNA array (more than 60,000 SNPs) to the studied Eucalyptus spp. was evaluated. The transferability rate in E. globulus (~ 14,000 SNPs) was higher than in E. cladocalyx (~ 3,800 SNPs), which can be explained by the fact that E. cladocalyx belongs to a genetically distant section from the Eucalyptus sections used in the preparation of the SNPs array. Consequently, fewer haplotype blocks were identified in E. cladocalyx population (~ 108) than E. globulus population (~ 1137). According to the results, the inclusion of haplotypes as predictor variables in GS models improved the predictive ability of low heritability (<0.1) traits. Additionally, the genomic heritability based on haplotypes was higher than those based on pedigree for these traits. On the other hand, the GS models had a better ability to predict the phenotypic traits evaluated in E. globulus than E. cladocalyx. In this sense, the low density of markers could be influencing the predictive ability of phenotypic traits of E. claodcalyx. A prediction approach was implemented that combines the benefits of GS, the quantitative trait loci mapping (QTLs) and the genetic structure of the population (genealogical antecedents), to obtain a greater predictive ability of the traits evaluated in E. cladocalyx. In conclusion, the haplotype approach could be especially beneficial to predict low heritability traits of Eucalyptus, in a context of the limited genetic base of these traits, due to the artificial selectionintensity. On the other hand, in populations that have not been subjected to artificial selection, the combined use of genetic structure and genomic information contribute to a better phenotypic prediction. The findings of this study could optimize the tree selection process and be useful for the forestry industry.Item Bases genómicas y transcriptómicas de la plasticidad en el uso de hospederos del parasitoide Aphidius ervi Haliday (Hymenoptera: Braconidae). Molecular mechanisms underpinning host fidelity in the parasitoid wasp Aphidius ervi Haliday (Hymenoptera: Braconidae)Autores: Ballesteros Teuber, Gabriel IgnacioProfesor Guía: Lavandero Icaza, Blas; Figueroa Caro, Alfredo ChristianLa agricultura moderna está basada en el uso de cultivos homogéneos y susceptibles al ataque de plagas, enfermedades y malezas, las que son controladas principalmente a través de aplicaciones de grandes cantidades de pesticidas de origen sintético. No obstante existen estrategias de control alternativas, tales como el uso de enemigos naturales introducidos, naturalizados, naturales o liberados para el control de plagas. Uno de los grupos de enemigos naturales de insectos más utilizados son las microavispas parasitoides, organismos que poseen un ciclo de vida que involucra el parasitismo de un insecto hospedero que finalmente ocasiona su muerte. En general, los parasitoides presentan una alta especificidad a un hospedero particular y son muy eficientes como controladores de la especie blanco. Sin embargo, se ha descrito que existen especies de parasitoides que presentan un amplio rango en el uso de hospederos y una gran variación fenotípica asociada a la elección y oviposición sobre diferentes insectos hospederos. Este es el caso del parasitoide Aphidius ervi, capaz de parasitar dentro de más de 20 especies de áfidos, por lo que se usa como controlador biológico de áfidos de importancia agrícola a nivel mundial. En Chile, este parasitoide fue introducido en la década de los 70s como agente controlador del áfido plaga de cereales Sitobion avenae. Sin embargo, en Chile también se han encontrado poblaciones de A. ervi sobre el pulgón de las leguminosas Acyrthosiphon pisum. De forma muy interesante, las poblaciones de A. ervi en Chile no evidencian signos de diferenciación genética entre poblaciones a pesar de que exhiben especialización conductual y preferencias por su hospedero natal (fidelidad al hospedero) respecto de hospederos alternativos no-natales. En efecto, parasitoides A. ervi no muestran diferencias en cuanto a su desempeño cuando se compara su tasa de reproducción entre S. avenae y A. pisum. En consecuencia, se ha propuesto que la preferencia hacia un hospedero natal en particular (fidelidad de hospedero) observada en A. ervi dependería tanto de factores ambientales (por ej., señales químicas del insecto hospedero y del cultivo atacado) como de factores heredables (por ej., marcas epigenéticas). En la siguiente tesis se propone que la fidelidad al hospedero en A. ervi sería consecuencia de una plasticidad transcripcional para genes relacionados con la percepción de estímulos químicos. La expresión diferencial de estos genes explicaría la plasticidad para rasgos fenotípicos como la elección y uso de hospederos. Además, se propone que algunos de estos mecanismos de detección de señales química estarían siendo regulados por mecanismos epigenéticos que actuarían como intermediarios entre el genotipo del individuo y el ambiente en donde se ha desarrollado (aprendizaje asociativo). En primer lugar, en esta tesis se determinó el efecto del desarrollo del parasitoide A. ervi dentro de un cierto áfido hospedero (S. avenae versus A. pisum) sobre los perfiles transcripcionales de hembras adultas a escala de transcriptoma completo, lográndose identificar un primer grupo de genes diferencialmente regulados entre parasitoides provenientes de ambos hospederos que podrían estar involucrados en la formación de la fidelidad al hospedero. Los resultados efectivamente sugieren que A. ervi presenta plasticidad fenotípica a nivel transcripcional, la que a su vez depende del origen poblacional de los parasitoides y que podría ser mediada por la relación planta-hospedero, descartándose que las avispas parasitoides utilicen las mismas estrategias a nivel molecular para parasitar hospederos natales y no-natales. En segundo término, se determinaron los efectos de realizar un transplante recíproco entre hospederos natales y no-natales sobre los niveles de expresión génica para genes candidatos codificantes para proteínas quimiosensoras en dos líneas de A. ervi provenientes de dos hospederos diferentes (A. pisum y S. avenae). Dado que los parasitoides son multiplicados en insectarios con fines comerciales para ser vendidos y luego liberados al campo (control biológico), adicionalmente se estudió el efecto de la crianza sobre el éxito del parasitismo a través de la comparación de niveles de expresión génica para el mismo set de genes quimiosensoriales estudiados previamente, entre poblaciones naturales de campo y poblaciones endogámicas de laboratorio. La falta de fidelidad al hospedero descrita previamente para poblaciones con altos niveles de endogamia (comparado con sus contrapartes de campo) pudo relacionarse con variaciones en mecanismos moleculares específicamente involucrados en la olfacción. Finalmente, se secuenció y ensambló de novo el genoma de A. ervi, utilizando una estrategia híbrida de ensamble que consistió en combinar librerías Illumina con una librería PacBio. Esta estrategia permitió obtener un ensamble genómico de alta calidad con bajo nivel de fragmentación (5,778 scaffolds). Con este genoma se logró predecir 20,226 genes codificantes a partir de la evidencia transcripcional obtenida previamente para A. ervi en esta tesis (capítulo II). Sorpresivamente no se encontró evidencia respecto de la metilación del DNA como mecanismo epigenético involucrado en la regulación génica de A. ervi, como sí ha sido descrito para otros himenópteros, en donde la metilación del DNA estaría involucrada en la regulación transcripcional en respuesta a cambios/factores ambientales. Estos resultados sugieren que, en A. ervi, la metilación del DNA no tendría un rol per se sobre la plasticidad fenotípica observada, a diferencia de lo que ocurre en otros himenópteros. Este genoma y los genes predichos utilizando evidencia transcripcional están disponibles públicamente y constituyen un aporte a la comunidad científica. En efecto, actualmente se están llevando a cabo una serie de estudios colaborativos que están dando luces de los mecanismos moleculares que posee A. ervi y que le permiten enfrentar ambientes cambiantes, lo que a su vez llevará a un mejor entendimiento de los factores que inciden en la eficacia de los parasitoides como agentes biocontroladores./ABSTRACT: Modern agriculture is mostly based on homogeneous crops, which are pest, disease and weed susceptible; this situation requires a permanent, mandatory input of synthetic pesticides into these oversimplified agroecosystems. Alternatively, biological control strategies are becoming an important part of sustainable pest control. These strategies are based on using introduced, naturalized, natural or released antagonistic agents to regulate population densities of other organisms. Parasitoids wasps are among the most widely used agents in biological control programs, as they lay eggs inside the body of host’s juvenile stages or adults, subsequently killing them during their development. Overall, parasitoids have been shown to be host specialist and can be employed in pest control without negative side effects due to potential impacts on non-target organisms. However, many parasitoid species exhibit broad host ranges, as well as phenotypic variation in selection and parasitization of different insect hosts. This is the case of Aphidius ervi, a parasitoid wasp capable of parasitizing over 20 different aphid species, being widely used in biological control programs of several relevant aphid pests worldwide. In Chile, this parasitoid was introduced from Europe in the late 70’s as a biological control agent of a cereal pest, the grain aphid Sitobion avenae. However, the introduced Chilean A. ervi wasps also parasitize the pea aphid Acyrthosiphon pisum, populations. Interestingly, even when parasitizing different aphid species, Chilean A. ervi populations do not exhibit signatures of genetic differentiation between them. Surpringsinly, although they do display variation in terms of host preference towards their natal host (host fidelity) compared to alternate hosts (non-natal hosts), no differences in fitness were observed in terms of reproductive rate between S. avenae and A. pisum. Hence, it has been proposed that the strong preference towards their natal host (host fidelity) observed in Chilean populations of A. ervi would depend on both environmental factors (i.e., chemical signals derived from the host insect and the plant species) and on heritable factors (i.e., epigenetic marks). In the following Thesis, it has been proposed that host fidelity in A. ervi is a consequence of transcriptional plasticity for genes involved in perception of chemical stimuli. Differential expression on these genes would in turn explain the phenotypic plasticity observed in terms of host selection and host preference. Additionally, it has been proposed that the perception of some of these stimuli is modulated by epigenetic mechanisms, which would be acting as mediators between the individual’s genotype and the environment where it developed, producing specific phenotypes. In this thesis we first examined the effect of rearing and development in two different aphid host species (Sitobion avenae versus Acyrthosiphon pisum) on the transcriptome of adult A. ervi females. This approach allowed us to identify several differentially expressed genes (which could be involved in host fidelity) when comparing parasitoids reared on different aphid host species. Our results suggest that A. ervi displays a significant phenotypic plasticity at transcriptional levels, which would depend on the aphid-plant complex that the parasitoid populations developed on. Hence, it is unlikely that these parasitoid wasps use the same strategies and/or molecular mechanisms to parasitize and exploit either a natal or non-natal aphid host. Second, the effects of reciprocal transplants between natal and no-natal hosts were determined in the expression levels of genes coding for chemosensory proteins in two different A. ervi lines reared on two different aphid hosts (A. pisum and S. avenae). As parasitoids are reared in small caged populations in commercial insectaries under laboratory conditions before being released to farms and/or natural environments, the effect of long-term rearing on the parasitism success was also studied by comparing the gene expression levels for the same chemosensory candidate genes between natural, field A. ervi populations and highly inbred populations reared in laboratory. In this way a relationship could be established between variations in molecular mechanisms specifically involved in olfactory perception with the reduced host fidelity described previously for highly inbred populations of A. ervi (compared to their counterparts from field). Finally, the A. ervi genome was sequenced and de novo assembled, using a hybrid assembly strategy which combined both Illumina libraries (short reads) and a Pacific Biosciences library (long reads) into a hybrid assembly. Using this strategy, a high-quality genome draft was obtained with reduced fragmentation levels (5,778 scaffolds). From this genome assembly, 20,226 coding genes were predicted by using as reference the transcriptional evidence for A. ervi obtained within this thesis (Chapter II). Surprisingly, no evidence was found supporting the existence of DNA methylation as an epigenetic mechanism involved in gene regulation of A. ervi, unlike other Hymenoptera species, where it has been described as an important mechanism involved in transcriptional regulation in response to environmental factors/changes. Thus, these results suggest that, in A. ervi, DNA methylation would not be responsible per se for the observed phenotypic plasticity. This genome assembly and predicted coding genes using transcriptional data are publicly available and constitute a valuable resource to the scientific community. Indeed, collaborative studies are currently being performed, aimed at addressing the molecular mechanisms present in A. ervi involved in responding to changing environments. This will lead to a better understanding of several key aspects of parasitoids’ biology affecting their efficacy as biological control agents of agricultural aphid pestsItem Análisis funcional del gen PdKTI3 de Populus deltoides. Rol de la proteína codificada en la tolerancia a exceso de cobreAutores: Campos Hernández, Carola AlejandraProfesor Guía: González, Enrique; Guerra Guerrero, Fernando PatricioLos álamos (Populus spp) han sido propuestos como especies candidatas para la fitorremediación de metales pesados en los suelos. Si bien el cobre (Cu) es un elemento traza esencial para las plantas, que participa como cofactor de muchas proteínas y desempeña un importante rol en procesos celulares, cuando está en exceso, se convierte en un elemento potencialmente tóxico. Recientemente, el análisis transcripcional de genes en álamos expuestos a exceso de Cu ha permitido identificar una serie de genes diferencialmente expresados relacionados con su respuesta frente al estrés. Entre éstos destacan genes que codifican para proteínas inhibidoras de tripsina del tipo kunitz (KTI), los que fueron significativamente inducidos por el Cu. Sin embargo, la función específica de este tipo de proteínas bajo estrés por metales pesados es muy poco conocida. En estudios previos, el gen PdKTI3 fue aislado, secuenciado, y la estructura de la proteína codificada fue modelada in silico. En ésta destacan dos putativos dominios de unión a Cu, lo que sugiere la capacidad de la proteína para quelar este metal. En ese contexto, para determinar su potencial rol en el marco de los mecanismos de tolerancia a Cu, en esta tesis se analizó funcionalmente el gen PdKTI3 y su correspondiente proteína, basándose en la hipótesis de que si PdKTI3 está asociado a la tolerancia al exceso de Cu, entonces su expresión en sistemas heterólogos sensibles debiera conferirles tolerancia a dicho metal. Para ello, se propusieron los siguientes objetivos: (1) establecer la capacidad de PdKTI3 para conferir tolerancia a Cu, mediante su expresión en sistemas heterólogos, (2) evaluar la participación de dominios de unión a Cu, presentes en la proteína PdKTI3, en la respuesta de tolerancia, y (3) establecer la localización subcelular de la proteína codificada por PdKTI3. Ensayos de transformación estable de PdKTI3 en plántulas de Arabidopsis thaliana demostraron que su expresión constitutiva confiere tolerancia a estrés por Cu, no obstante, esta tolerancia está limitada a un determinado nivel de expresión del gen. Por otro lado, considerando la estructura de PdKTI3 previamente modelada, en esta investigación, ambos sitios de unión a Cu fueron mutados in silico, sin que se observara un efecto significativo en su estructura tridimensional. Luego, el gen PdKTI3 fue modificado mediante mutagénesis 12 sitio-dirigida, y utilizado para complementar una cepa de levadura (Saccharomyces cerevisiae) sensible a Cu (cup2Δ), mediante ensayos de tolerancia y cinética de crecimiento, en medios sólidos y líquidos, respectivamente. La evaluación del efecto de las mutaciones sobre la tolerancia al metal mostró que ambos sitios de unión son funcionales. Finalmente, la expresión transitoria de PdKTI3 en catáfilos de cebolla y células epidermales de tabaco, en conjunto con la utilización de marcadores organelo-específico, permitió precisar su ubicación subcelular. Los ensayos revelaron que PdKTI3 está localizada en la vacuola y el retículo endoplasmático, y cercanamente relacionada con la membrana plasmática. Los resultados obtenidos sugieren un nuevo papel para proteínas KTI, particularmente como elemento de interacción con Cu frente al estrés por este metal. PdKTI3 interactuaría con los iones de Cu a nivel de vacuola, compartimentalizando y confiriendo tolerancia a este metal. La caracterización de este nuevo mecanismo molecular de respuesta representa un aporte para el desarrollo de futuras aproximaciones biotecnológicas tendientes a la generación de plantas útiles para fitorremediación./ABSTRACT: Poplars (Populus spp) have been proposed as candidate species for the phytoremediation of heavy metals in soils. Although copper (Cu) is a trace element for plants, it participates as a cofactor of many proteins and plays an important role in cellular processes, when it is in excess, it becomes a potentially toxic element. Recently, the transcriptional analysis of genes in poplars exposed to Cu excess has allowed to identify a series of differentially expressed genes related to their response to stress. Among these genes are those encoding Kunitz trypsin inhibitor proteins (KTI), which were significantly up-regulated by Cu. However, the specific function of these proteins under heavy metal stress still remains almost unknown. In previous studies, the PdKTI3 gene was isolated, sequenced and the structure of the encoded protein was modeled in silico. In this stage, two putative Cu binding domains were identified, suggesting the ability of the protein to chelate this metal. In this context, in order to determine its potential role in the framework of Cu tolerance mechanisms, in this thesis the PdKTI3 gene and its corresponding protein were functionally analyzed. The underlying hypothesis considered that if PdKTI3 is associated with tolerance to excess of Cu, then its expression in sensitive heterologous systems should confer tolerance to this metal. For testing that hypothesis, the following objectives were proposed: (1) to establish the ability of PdKTI3 to confer tolerance to Cu, through its expression in heterologous systems, (2) to evaluate the participation of the Cu binding domains, of PdKTI3 protein, in the tolerance response, and (3) to define the subcellular localization of the protein encoded by PdKTI3. The stable transformation assays of PdKTI3 in Arabidopsis thaliana seedlings showed that can confer tolerance to Cu stress. However, this tolerance is limited to specific levels of gene expression. On the other hand, considering the structure of PdKTI3 previously modeled, in this research work, both Cu binding sites were mutated in silico, without a significant effect on its three-dimensional structure. Then, the PdKTI3 gene was modified by site-directed mutagenesis, and used to complement a Cu-sensitive strain of yeast (Saccharomyces cerevisiae) (cup2Δ), in solid and liquid media, characterizing its performance by tolerance and growth kinetic assays. The analysis of the effect of mutations on metal tolerance showed that both binding sites are functional. Finally, the transient expression of PdKTI3 in onion and tobacco epidermal cells, along with the use of specific organelle markers, allows to identify its subcellular location. The results indicated that PdKTI3 is found in the vacuole and the endoplasmic reticulum, and closely related to the plasma membrane. The results suggest a new role for KTI proteins, particularly as a molecule that interacts with Cu, under stress conditions. PdKTI3 would interact with Cu ions at the vacuole level, suggesting their compartmentalization and conferring tolerance to this metal. The characterization of this new molecular mechanism of response represents a support for the development of future biotechnological approaches suitable for generating phytoremediation systems.Item Actividad alcohol aciltransferasa, efecto de la disponibilidad de sustratos sobre la producción de ésteres en frutos de Physalis peruviana L.Autores: Zúñiga Hormazábal, Rafael EnriqueProfesor Guía: Moya León, AlejandraAroma y sabor son los atributos de calidad que afectan de manera más importante el consumo de frutas. La producción de compuestos volátiles que generan el aroma, es un factor determinante de la calidad sensorial de la fruta, y la aceptación del consumidor. La obtención y generación de información cualitativa y cuantitativa, que permita la caracterización de compuestos que producen aroma, es de gran relevancia para el mejoramiento y mantención de la calidad de la fruta. Physalis peruviana Linnaeus produce frutos climatéricos que se caracterizan por su sabor e intenso aroma, propiedades que se desarrollan durante la maduración. En frutos de P. peruviana, los ésteres representan un grupo de gran diversidad. Sin embargo, a pesar del creciente interés y demanda por goldenberry en los mercados internacionales, no existen estudios bioquímicos relacionados con la formación de ésteres durante la maduración, e información de enzimas implicadas en la generación del aroma en goldenberry. Mediante headspace-SPME fue posible identificar y cuantificar diferentes compuestos durante la maduración de goldenberry. Los compuestos dominantes fueron ésteres con abundante impacto en el aroma, siendo butanoato de etilo, acetato de etilo, butanoato de hexilo, butanoato de butilo, acetato de hexilo, y acetato de butilo los más abundantes en frutos maduros. Como los ésteres son los principales volátiles producidos por goldenberry y son sintetizados por la acción de la enzima alcohol aciltransferasa (AAT), se aisló un cDNA de largo completo (PhpAAT1) de 1799 pb desde frutos de P. peruviana. La secuencia polipeptídica deducida de 440 aminoácidos, presentó los dominios característicos de la superfamilia BAHD: el motivo del sitio activo (HxxxD), y el motivo altamente conservado (DFGWG) localizado en el extremo carboxilo terminal de la enzima. El análisis filogenético indicó que PhpAAT1 está estrechamente relacionado con genes AAT de la familia III, cuyos miembros participan en la síntesis de compuestos volátiles en frutos. El análisis de qPCR mostró que PhpAAT1 se expresa de manera intensa en goldenberry en estado maduro, y es indetectable en tejidos vegetativos. En frutos, el incremento en la producción de compuestos de aroma durante la maduración es concidente con el aumento en la acumulación de transcritos de PhpAAT1 y actividad AAT. El suministro de alcoholes reflejó que la producción de ésteres está limitada y determinada por la disponibilidad de precursores. Los resultados sugieren que el gen PhpAAT1 está involucrado en la biosíntesis de aroma en goldenberry, y la producción de ésteres depende de la actividad AAT y de la disponibilidad de sustratos. /ABSTRACT: Aroma and flavour are the most important attributes and quality criteria that affect the consumption of fruits. The production of volatile aroma compounds is an important factor determining the sensory quality of fruit and consumer acceptance. The generation of qualitative and quantitative information that allows the characterization of aroma compounds, is of great importance for the improvement and maintenance of fruit quality. Physalis peruviana Linnaeus produces a climacteric fruit characterized for having great aroma and flavor properties that develops during ripening. In P. peruviana fruits, esters represent a very diverse group of compounds. However, despite the growing interest and demand for goldenberry in the international market, there are no biochemical studies related to the formation of esters during ripening, and information of enzymes involved in the generation of aroma in goldenberry. Using headspace-SPME different volatile compounds were identified and quantified during the ripening of goldenberry. The headspace was dominated by esters with great aroma impact, being ethyl butanoate, ethyl acetate, hexyl butanoate, butyl butanoate, hexyl acetate, and butyl acetate the most abundant in fully ripe fruit. As esters are the main volatile compounds produced by goldenberry and are synthesized through alcohol acyltransferases (AAT), a full-length cDNA (PhpAAT1) of 1799 bp was isolated from P. peruviana fruit. The deduced polypeptide sequence of 440 amino acids displayed the characteristic domains of most BAHD superfamily plant acyltransferases: the active site motif (HxxxD) and the highly conserved motif located towards the C-terminal end (DFGWG). Phylogenic analysis indicates that PhpAAT1 gene is closely related to AAT genes belonging to subfamily III, whose members participate in the synthesis of volatile compounds in fruit. The transcript accumulation pattern provided by qPCR analysis showed that PhpAAT1 gene was highly expressed in fruit at the ripe stage, and it was undetectable in vegetative tissues. An increase in the production of aroma-related esters was found during ripening of the fruit which is coincident with the increase in PhpAAT1 transcript accumulation and AAT activity. In addition, the supply of alcohols reflected that the production of esters is limited and determined by the availability of precursors. These results suggest that PhpAAT1 gene is involved in aroma biosynthesis in goldenberry fruit, and the production of esters dependent on the AAT activity and the availability of substrates.Item Caracterización de un factor de transcripción de la familia NAC y su rol en el proceso de ablandamiento en frutos de Fragaria chiloensis L. (Duch.)Autores: Carrasco Orellana, Cristian RicardoProfesor Guía: Herrera Faúndez, RaúlFragaria chiloensis es una rosacea endémica de chile, la cual genera un fruto con particulares características como atractivo sabor, agradable aroma, alta tasa fotosintética, resistencia a enfermedades, el cual ha sido propuesto como recurso agronómico de exportación dado el interés económico que este genera. Sin embargo, este fruto presenta un periodo de post-cosecha muy limitado y su ablandamiento es muy rápido. Este hecho, ha generado un desplazamiento del fruto de F. chiloensis por otros cultivares como Frutilla comercial (F. x ananassa) provenientes de Norte América, el cual presenta un ablandamiento menos acelerado. Como el mercado nacional e internacional ha aumentado la demanda de frutos más llamativos y exóticos, F. chiloensis se ha convertido en una nueva alternativa de exportación para nuestro país y ha emergido como una especie de estudio de eventos asociados a la maduración y ablandamiento de frutos. La madurez de un fruto se circunscribe en la sinérgia de procesos tanto fisiológicos como bioquímicos dados en etapas de su desarrollo. La maduración de los frutos de especies de Fragaria, los cuales son clasificados como frutos no climatéricos, son regulados por la participación de diversos factores moleculares, entre ellos factores de transcripción, los cuales son familias de proteínas que coordinan y regulan la expresión de un gen o de un grupo de genes, y en muchos casos, regulan su propia expresión. Los factores de transcripción de la familia NAC (NAM, ATAF1,2 y CUC2) son específicos de plantas y realizan distintas funciones promoviendo la regulación transcriptional de diversos tipos de genes, entre ellos, algunos descritos que presentan relación directa con modificaciones fisiológicas y cambios en la pared celular que ocurren durante la maduración de los fruto, tales como Poligalacturonasas, Pectatoliasas, Endoglucanasas, Expansinas, Xiloglucano Endotransglicosilasas/hidrolasas, entre otros, los cuales presentan en sus zonas promotoras elementos en cis que son reconocidos por factores de transcripción de la familia NAC. El rol de los factores de transcripción de la familia NAC en el proceso de maduración y ablandamiendo en frutilla chilena, es a la fecha, desconocido y surge la necesidad de realizar estudios para poder entender este proceso. Por esta razón, el objetivo de esta tesis doctoral fue identificar, clonar y caracterizar un factor de transcripción de la familia NAC (FcNAC1) de F. chiloensis, el cual presentó un cDNA compuesto por 999 bp que codifica una proteína de 332 aminoácidos y que presenta en su zona amino terminal el dominio conservado de la familia NAC. Se realizaron análisis filogenéticos con miembros de esta familia con función conocida y fue posible apreciar que FcNAC1 presenta cercanía evolutiva con SND2 (SECONDARY WALL-ASSOCIATED NAC DOMAIN PROTEIN 2), el cual está involucrado en la remodelación de la pared celular. Mediante transformación transciente de hojas de tabaco por agroinfiltración, fue posible determinar la localización sub-celular de nuestro factor de transcripción evidenciado que este se encuentra en el núcleo. También se determinó la variación en la expresión de FcNAC1 durante el desarrollo y maduración del fruto, donde fue posible determinar que los niveles de transcritos aumentan concomitante al proceso de maduración y desarrollo del fruto, además fue posible apreciar que el perfil transcripcional en tejidos vegetativos presentó una mayor acumulación de estos en flores, paso previo a la formación del fruto, no así en otros tejidos como raíces, estolones, hojas y tallos. Mediante la técnica Genome-walker, fue posible obtener un fragmento de 1488 pb concerniente al promotor del gen FcNAC1 y mediante análisis in-sílico se pudo evidenciar putativos elementos en cis de respuesta a señales hormonales, como también sitios de reconocimiento para factores de transcripción de la familia NAC denominados SNBEs (Secondary wall NAC binding elements). Con el objetivo de entender sobre la regulación transcripción a nivel hormonal de FcNAC1, se realizaron ensayos de tratamientos hormonales en frutos, donde se pudo apreciar que existe un efecto de regulación positiva por ácido abscísico y una regulación negativa por parte de auxinas (IAA) en el experimento realizado. Para poder indagar sobre la conformación estructural del factor de transcripción FcNAC1 y haciendo uso de herramientas bioinformáticas, fue posible obtener la estructura tridimensional de la proteína, su conformación como homodímero, su interacción en el reconocimiento del DNA y se describe aquellos residuos importantes que permiten la estabilización de esta interacción. Como se desconocía la función que podría estar realizando este factor de transcripción, se realizó una transactivación transcripcional mediante un ensayo de luciferasa dual, donde fue posible apreciar que FcNAC1 presenta actividad transcripcional contra la secuencia promotora de un gen relacionado a la remodelación de la pared celular, lo que permite inferir que FcNAC1 estaría involucrado en el proceso de remodelación de pared celular, evento concomitante con el ablandamiento de los frutos de F. chiloensis. Ademas, fue posible identificar otro miembro de esta familia, denominamdo FcNAC2, compuesto de un cDNA de 1038 bp que codifica una proteína de 346 aminoácidos y que tambien presenta el dominio conservado de la familia NAC en su zona amino terminal. Al realizar análisis filogenéticos fue posible apreciar que FcNAC2 presenta cercanía evolutiva con AtNAC2 (NAC-REGULATED SEED MOPHOLOGY 1, NARS1), del cual se describe que podría estar involucrado en la incorporación de estimulos medioambientales y endógenos en el proceso de desarrollo de raíces laterales. Se evaluaó la expresión relativa de FcNAC2 en fruto y en tejidos vegetativos, donde fue posible apreciar que los niveles de transcritos aumentan conforme avanza el proceso de desarrollo y maduración del fruto y presentó un alto nivel de transcritos en raíces, tallos y estolones. Finalmente, ensayos de luciferasa dual nos sugieren que FcNAC1 y FcNAC2 podrían estar interactuando conjuntamente promoviendo la expresión de genes relacionados a la remodelación de la pared celular./ABSTRACT:of environmental and endogenous stimuli in the lateral root development process. The relative expression of FcNAC2 in fruit and in vegetative tissues was evaluated, where it was possible to appreciate that transcript levels increase as the fruit development and maturation process progresses and presenting a high transcripts level in roots, stems and stolons. Finally, dual luciferase assays suggest that FcNAC1 and FcNAC2 could be interacting together promoting the expression of genes related to cell wall remodeling. Fragaria chiloensis is a one endemic rosacea from Chile, which produces a fruit with interesting characteristics such as an attractive taste, pleasant aroma, disease resistance. This specie has been proposed as an agronomic resource for exportation, together with the economic interest which generates. However, this fruit show a limited post-harvest period and a fast softening process. This fact has generated a displacement of the F. chiloensis fruit by other cultivars such as the commercial strawberry (F. x ananassa) from North America, which presents more firmess after ripening. As the national and international market has increased its demand for more attractive and exotic fruits, F. chiloensis has become a new alternative for export our country and has emerged as a model for studies associated to ripening and softening of fruits. The fruit maturity is circumscribed in a synergic process such physiological and biochemical at development stages. The fruit madurity in Fragaria species, which are non-climacteric fruits, are regulated by the participation of various molecular factors, including transcription factors, which are family proteins that coordinate and regulate the expression of a gene or group of genes, and in many cases, regulate their own expression. The transcription factors of the NAC family (NAM, ATAF1,2 and CUC2) are plant-specific and perform different functions promoting the transcriptional regulation of various types of genes, including some described that are directly related to physiological modifications and changes in cell walls. This changes occur during fruit maturation and alter enzymes such as, Polygalacturonases, Pectatolyases, Endoglucanases, Expansines, Xyloglucan Endotransglycosilases/hydrolases, among others, which have in their promoter zones cis elements that are recognized by transcription factors of the NAC family. The role in the maturation and softening process of NAC transcription factors family in Chilean strawberry is, to date, unknown. This fact arises the need to carry out more studies in order to understand this process. For this reason, the objective of this doctoral thesis was to identify, clone and characterize a NAC from F. chiloensis (FcNAC1), which presented a cDNA sequence of 999 bp, that encodes a protein of 332 amino acids and present the conserved domain of the NAC family in its amino terminal. Phylogenetic analyzes were performed with members of this family with known function and it was possible to appreciate that FcNAC1 presents an evolutionary closeness with SND2 (SECONDARY WALL-ASSOCIATED NAC DOMAIN PROTEIN 2), which is involved in cell wall remodeling. Through trans-transformation of tobacco leaves by agroinfiltration, it was possible to determine the subcellular location of our transcription factor evidenced that is found in the nucleus. The variation in FcNAC1 expression during fruit development and maturation was also determined, where it was possible to see that the transcript levels increase concomitant to the maturation and fruit development process, in addition it was possible to appreciate that the transcriptional profile in vegetative tissues presented a greater accumulation of these in flowers, previous to the fruit formation step, albeit, not accumulation of transcript was observed in other tissues as roots, stolons, leaves and stems. Using Genome-walker technique, it was possible to obtain a 1488 bp fragment concerning to FcNAC1 promoter sequence and through in-silico analysis it was possible to evidence putative cis elements in response to hormonal signals and also the recognition sites for the NAC family called SNBEs (Secondary wall NAC binding elements). In order to understand the hormonal transcription regulation of FcNAC1, hormonal treatments in fruits were carried out, where it was possible to see that there is a positive regulator effect by abscisic acid and a negative regulation by auxins (IAA). In order to investigate the structural conformation of FcNAC1 and making use of bioinformatic tools, the three-dimensional protein structure was obtained, its homodimer conformation, its DNA recognition interaction and important residues that allow the stabilization of this interaction is described. A transcriptional transactivation was performed by dual luciferase assay, where it was possible to appreciate that FcNAC1 has transcriptional activity against a promoter sequence of a gene related to cell wall remodeling, which allows us to suggest that FcNAC1 would be involved in the cell wall remodeling process, concomitant event with the fall of firmness of F. chiloensis fruits. In addition, another member of this family which we named FcNAC2 was identified, composed of 1038 bp cDNA that encodes a protein of 346 amino acids and also presenting the conserved NAC domain in its amino terminal zone. When phylogenetic analyzes was performed, it was possible to see that FcNAC2 presents evolutionary closeness with AtNAC2 (NAC-REGULATED SEED MOPHOLOGY 1, NARS1), which describes that it could be involved in the incorporation of of environmental and endogenous stimuli in the lateral root development process. The relative expression of FcNAC2 in fruit and in vegetative tissues was evaluated, where it was possible to appreciate that transcript levels increase as the fruit development and maturation process progresses and presenting a high transcripts level in roots, stems and stolons. Finally, dual luciferase assays suggest that FcNAC1 and FcNAC2 could be interacting together promoting the expression of genes related to cell wall remodeling.Item Análisis del rol funcional de dos factores de transcripción MADS-box inducidos en respuesta a inclinación en Pinus radiata D. DonAutores: Cruz Rosero, Nicolás JavierProfesor Guía: Herrera Faúndez, RaúlLa pérdida del crecimiento vertical producto de la inclinación de los tallos en coníferas por algún estrés abiótico genera la formación de madera de reacción. Esta respuesta se debe a tensiones físicas que sufre el árbol al tratar de reorientar su posición original. Esto provoca un cambio en el programa genético, donde la expresión y regulación de genes involucrados, así como los mecanismos moleculares que participan de este proceso, aún no están del todo claro. En base a lo anterior, en la presente tesis doctoral se propuso analizar el rol funcional de dos factores de transcripción de Pinus radiata D. Don tipo MADS-box, expresados diferencialmente en respuesta a inclinación y posteriormente evaluados en Arabidopsis thaliana. Plántulas de pino fueron inclinadas en ángulo de 45º y mantenidas por 2,5 horas, identificándose estos dos factores de transcripción. Secuencias parciales de estos factores de transcripción fueron identificadas y aisladas previamente mediante la técnica de Hibridación Sustractiva Supresiva (SSH) en respuesta al estímulo de inclinación en la especie antes indicada. Estas secuencias aisladas desde tallo nos permiten sugerir que estos factores de transcripción tipo MADS-box que responden a inclinación en P. radiata, regularían la expresión de genes que codifican para enzimas de la ruta de biosíntesis de fenilpropanoides en Arabidopsis. Mediante RACE 5´- y 3´- se logró obtener el largo completo de dos genes que codifican para factores de transcripción tipo MADS-box, nombrados como PrMADS10 y PrMADS11. PrMADS10 corresponde a una secuencia de 943 pb, tiene un marco de lectura abierto (ORF) de 582 pb y su secuencia polipeptídica deducida de 193 aa, su número de accesión GenBank es KM887510. Por su parte, PrMADS11 corresponde a una secuencia de 871 pb, tiene un marco de lectura abierto (ORF) de 495 pb y su secuencia polipeptídica deducida de 165 aa, su número de accesión GenBank es KM887511. Las dos secuencias obtenidas muestran un alto porcentaje de identidad con genes que codifican para factores de transcripción del tipo MADS-box presentes en otras especies de plantas. PrMADS10 y PrMADS11 contienen dominios conservados típicos de los MADS-box, correspondientes a los motivos MADS y Kbox, indicando que estas estructuras están presentes en proteínas tipo MIKC. Los niveles de transcrito de PrMADS10 y PrMADS11 fueron analizados en tallo de pino inclinado a 45° y control (sin inclinar) a diferentes tiempos de la respuesta. Los análisis de qPCR para ambos genes mostraron una acumulación del transcrito de forma diferencial, siendo mayor en la parte inferior del tallo de pino a los 60 y 120 minutos, cuando es sometido a inclinación. Estos resultados sugieren que PrMADS10 y PrMADS11 responden a tiempos tempranos, y su expresión es diferencial en tiempo y en sección de tallo. Las proteínas PrMADS10 y PrMADS11 de pino radiata fueron inducidas en Saccharomyces cerevisiae. Se logró producir y purificar proteína recombinante utilizando este sistema heterólogo, obteniendo proteínas con una masa de 22 kDa y 19 kDa. Sin embargo, no se pudo determinar si las dos proteínas tienen la capacidad de interactuar con elementos de respuestas presentes en la región promotora de los genes modulados. Para determinar la función de los factores de transcripción de pino se realizó análisis mediante microarreglos. Para ello, se generaron varias líneas transgénicas homocigotas de Arabidopsis thaliana que sobreexpresan PrMADS10 y PrMADS11. Se usó como control la respectiva línea homocigota transformada con el vector vacío (control). El crecimiento, desarrollo y otras características morfológicas observadas de las plantas transgénicas obtenidas fue normal. Para el ensayo de microarreglos se utilizó el chip AraGene-1_0-ST 90k, que contiene aproximadamente 26.000 genes de Arabidopsis anotados por Affimetrix. Los resultados de los microarreglos muestran que PrMADS10 regula la expresión diferencial de 1211 genes y PrMADS11 regula 947 genes. Cuando se compararon ambos factores de transcripción se observó que regulan 679 genes en común. El ensayo de microarreglos realizado permitió identificar genes que son regulados positiva y negativamente por ambos PrMADS. Además, cada factor de transcripción regula genes específicos y otros que son comunes. De los 50 genes seleccionados por su mayor tasa de cambio, se pudo observar que los niveles de expresión son diferentes para ambos casos, pero también, genes expresados en plantas y que expresan ambos genes presentan distintos patrones de expresión, lo cual podría dar cuenta de la diferencia estructural entre ambas proteínas. Se identificaron genes implicados en división celular, hormonas, biosíntesis de celulosa, deposición de lignina, organización y degradación de la pared celular, tales como: sucrose synthase 4 (SUS4), rhamnose biosynthesis 3, Basic chitinase, microtubule-associated proteins 70-5 (MAP70-5), MYB domain protein, expansina A8 (EXPA8), proline-rich protein 2 (PRP2) y pectin lyase-like superfamily protein, cellulose synthase like A15 (CSLA15) y xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase 15 (XTH15). Mediante el programa MapMan se determinó que la totalidad de los genes son regulados diferencialmente por ambos factores de transcripción, observándose que estos codifican proteínas presentes en varias rutas metabólicas, tales como metabolismo de los carbohidratos, metabolismo de aminoácidos, metabolismo secundario, síntesis de pared celular y lípidos. Asimismo, los factores de transcripción estarían modulando el metabolismo secundario, pues se encontró expresión diferencial de genes de la ruta de biosíntesis de fenilpropanoides. Los genes regulados por PrMADS10 fueron PAL, CHS, 4CL, CCR y CCoAOMT y los regulados por PrMADS11 fueron PAL, 4CL y CCoAOMT, la información obtenida muestra que los dos MADS-box están regulando genes en común, como PAL, 4CL y CCoAOMT, sin embargo, PrMADS10 está regulando otros genes c omo CHS y CCR. Para validar estos resultados se realizó un estudio del perfil transcripcional de los genes de esta ruta en plantas transgénicas de Arabidopsis sobreexpresando los genes PrMADS10 y PrMADS11 mediante análisis de qPCR. Los resultados obtenidos para PrMADS10 mostraron una mayor acumulación de transcritos de los genes PAL y COMT, este último en la ruta final de la biosíntesis de lignina. En cuanto al PrMADS11, éste también mostró una mayor acumulación en el gen PAL, así como también, una mayor acumulación de los trascritos de los cuatro genes de la ruta biosíntesis de lignina (CCR, CCoAOMT, CAD y COMT). Lo anterior, indica que estos genes podrían estar regulando las etapas finales de la biosíntesis de fenilpropanoides, especialmente los que conducen a la síntesis de lignina. Asimismo, para corroborar esta información se evaluó el contenido de lignina para los dos MADS-box, mostrando que el contenido de lignina en las líneas transgénicas T1, T2 y T7 de PrMADS10 fue 30% superior a las plantas de Arabidopsis silvestre (wt) y la línea homocigota transgénica transformada con el vector pBI121 vacio (mock). De igual forma, en PrMADS11 en las líneas transgénicas T1 y T3 hubo un 25% más contenido de lignina al ser comparadas con las plantas control. El análisis de los microarreglos indica que los MADS-box estudiados están regulando la ruta de biosíntesis de fenilpropanoides. Asimismo, se muestra por qPCR que estos PrMADS estarían regulando la rama de biosíntesis de lignina. Por otro lado, el análisis del contenido de lignina en plantas de Arabidopsis mostró que sus contenidos totales de lignina, fueron superior al control. Ello permite sugerir que su función sería regular la acumulación de lignina en Arabidopsis. Nuestros resultados contribuyen a la comprensión del papel de los factores de transcripción MADS-box que se expresan diferencialmente poco después de la inclinación de los tallos de pino. Esta es la primera investigación que caracteriza MADS-box que desempeñan un papel en el desarrollo del tallo, e regula otros genes, así como la xilogénesis y el aumento de la síntesis de lignina. Los resultados obtenidos en la presente tesis nos permite aceptar la hipótesis planteada “Factores de transcripción tipo MADS-box que responden a inclinación en P. radiata, regulan la expresión de genes de la ruta de biosíntesis de fenilpropanoides aumentando la acumulación de lignina en Arabidopsis”./ABSTRACT: TThe loss of vertical growth, due to the inclination of stems in conifers by abiotic stress, results in reaction wood formation. This response is due to physical stresses that trees undergo when trying to reorient its original position. This causes a change in the genetic program, where both expression and regulation of genes involved, as the molecular mechanisms involved in this process are still unknown. The aim of this doctoral thesis was to evaluate the functional role of two MADS-box transcripti on factors of Pinus radiata D. Don, differentially expressed in response to bending stress. Pine seedlings were tilted at 45° during 2.5 hours. Partial sequences of MADS-box transcription factors were obtained from a substractive suppression hybridization (SSH) technique in response to the tilt stimulus in the above species. These isolated sequences from the stem allow suggest that these transcription factors MADS-box type that respond to an inclination in P. radiata, would regulate the expression of genes that code for the enzymes of the phenylpropanoid biosynthesis pathway in Arabidopsis. The complete length of two genes encoding the transcription factors MADS-box type, was obtained using RACE 5'- and 3'. The sequences obtained were named PrMADS10 and PrMADS11. PrMADS10 corresponds to a 943 bp sequence, has an open reading frame (ORF) of 582 bp and polypeptide sequence deduced of 193 amino acids, the GenBank accession number is KM887510. The second sequence, PrMADS11 corresponds to a sequence of 871 bp, has an open reading frame (ORF) of 495 bp and a polypeptide sequence deduced of 165 amino acids, the accession number GenBank is KM887511. The two sequences obtained show high percentage of identity with genes encoding for transcription factors of the MADS-box type present in other plant species. PrMADS10 and PrMADS11 contain conserved domains typical of the MADS-box, corresponding to the MADS and Kbox motifs, indicating that these structures are present in MIKC-like proteins. The transcript levels of PrMADS10 and PrMADS11 were analyzed on stems of pine tilted at 45° and control (without tilting) at different response times. The analyzes of qPCR for both genes showed a differential transcript accumulation, being higher in the lower part of the pine stem at 60 and 120 minutes, when it is submitted to inclination. These results suggest that PrMADS10 and PrMADS11 respond to early times, and their expression is differential in time and in stem section. The radiata pine PrMADS10 and PrMADS11 proteins were expressed in Saccharomyces cerevisiae. It was possible to produce and purify both recombinant proteins using heterologous system. The proteins showed a mass of 22 kDa (PrMADS10) and 19 kDa (PrMADS11); however, it was not possible to determine whether the two proteins have the ability to interact with response elements present in the promoter region of the modulated genes. In order to determine the function of pine transcription factors, a microarray analysis was performed. For this, several homozygous transgenic lines were generated in Arabidopsis thaliana overexpressing PrMADS10 and PrMADS11. The respective homozygous line transformed with the empty vector (control) was used as control. The growth, development and other measured morphological characteristics of the transgenic plants obtained were normal. The AraGene-1_0-ST 90k chip, which contains approximately 26.000 Arabidopsis genes annotated by Affimetrix, for microarray assays was used. The result the microarray showed that PrMADS10 regulates the expression of 1211 genes while PrMADS11 regulates 947 genes. When both transcription factors are compared, they are regulating 679 genes in common. The microarray assay performed allowed to identify genes that are regulated positively and negatively by both PrMADS. In addition, each transcription factor regulates specific genes and others that are common. Of the 50 genes selected for their highest rate of change it is interesting that the expression levels are different for both cases, but at the same time, genes expressed in both constructs present diffe account for the structural difference between both proteins. Genes involved in cell division, hormones, cellulose biosynthesis, lignin deposition, cell wall organization and degradation were identified, such as sucrose synthase 4 (SUS4), rhamnose biosynthesis 3, Basic chitinase, microtubule-associated proteins 70-5 (MAP70-5), MYB domain protein, expansin A8 (EXPA8), proline-rich protein 2 (PRP2) and pectin lyase-like superfamily protein, cellulose synthase like A15 (CSLA15) and xyloglucan endotransglucosylase / hydrolase 15 (XTH15). The MapMan program determined that all genes are differentially regulated by both transcription factors and that these are present in several metabolic pathways such as carbohydrate metabolism, amino acid metabolism, secondary metabolism, cell wall and lipids. It would also be modulating the secondary metabolism, was found differential expression of genes of the phenylpropanoid biosynthetic pathway. The genes regulated by PrMADS10 are PAL, CHS, 4CL, CCR and CCoAOMT and those regulated by PrMADS11 were PAL, 4CL and CCoAOMT, the information obtained shows that the two MADS-box genes are regulated in common, such as PAL, 4CL and CCoAOMT, however, PrMADS10 is regulating other CHS and CCR genes. To validate those genes, a transcriptional profile of the genes involved in this route was carried out in transgenic plants of Arabidopsis overexpressing PrMADS10 and PrMADS11 by means of analysis of qPCR. The results obtained for PrMADS10 show a greater accumulation of transcripts of the PAL and COMT genes, the latter in the final pathway of lignin biosynthesis. For PrMADS11, it also showed a greater accumulation in the PAL gene, as well as a greater accumulation of the transcripts of the 4 genes of the lignin biosynthetic pathway (CCR, CCoAOMT, CAD and COMT). The results suggest that these genes could regulate the final stages of the biosynthesis of phenylpropanoids, especially those leading to lignin synthesis. In order to corroborate this information, the lignin content for the two MADSboxes was evaluated, showing that the lignin content in the T1, T2 and T7 transgenic lines of PrMADS10 was 30% higher than the wild-type Arabidopsis (wt) and the transgenic homozygous line transformed with the empty pBI121 vector (mock). Likewise, PrMADS11 in the transgenic lines T1 and T3 there was a 25% more lignin content when compared to the control plants. The results of the microarrays analyzes showed that the MADS-box studied are regulating the biosynthesis pathway of phenylpropanoids. Likewise, the results of the qPCR for these PrMADS indicate that they would be regulating the lignin biosynthesis branch. Moreover, the analysis of the lignin content in plants of Arabidopsis that overexpress showed that their total contents of lignin was superior to 30 and 25% respectively, when they were compared against the controls; this allows to suggest that their function would be to regulate the accumulation of lignin in Arabidopsis, results that could be extrapolated to pine plants. Moreover, the analysis of the lignin content in Arabidopsis plants showed that their total lignin contents were superior to the control. This suggests that its function would be to regulate the accumulation of lignin in Arabidopsis. Our results contribute to the understanding the role of transcription factors MADS-box that are differentially expressed shortly after the inclination of pine stems. This is the first research that characterizes MADS-box that play a role in stem development, regulates other genes, as well as xylogenesis and increased lignin synthesis. The results obtained in this thesis allow us to accept the hypothesis “Transcription factors MADS-box type that respond to tilt in P. radiata, regulate the expression of genes of the phenylpropanoid biosynthesis pathway increasing the lignin accumulation in ArabidopsisItem Estudio de la diversidad funcional de la familia fitoeno sintasa (PSY) en Brassica napus L. e ingeniería metabólica del contenido de carotenoidesAutores: López Emparán, Ada ElizabethFitoeno sintasa (PSY) es la enzima que cataliza el primer paso de la ruta de síntesis de carotenoides. En Arabidopsis thaliana, PSY es codificada por un único gen. En otras especies se ha reportado la existencia de familias de genes PSY. En Brassica napus, se ha determinado la existencia de una familia de genes PSY conformada por seis miembros que presentan expresión tejido-específica, sin embargo, se desconoce si todos ellos codifican proteínas funcionales. Por otra parte, se ha demostrado que en esta especie, PSY es un paso limitante en la síntesis de carotenoides. Esta limitación fue demostrada a través de un trabajo dónde la sobreexpresión de un gen PSY de origen bacteriano resultó en un incremento de 50 veces los niveles de β-caroteno en semilla de B. napus. Además, se ha demostrado que el uso de diferentes fuentes de transgen PSY puede aumentar el contenido de carotenoides a diversos niveles. En este contexto, resultó importante investigar si los seis genes PSY de B. napus son funcionales y determinar cuáles representaban la mejor alternativa para seleccionar uno y sobreexpresarlo en semillas de B. napus L. En este estudio se aislaron las secuencias CDS de los seis miembros de la familia de genes PSY de B. napus y se confirmó que los seis codifican proteínas con alta identidad de secuencias, con una estructura tridimensional similar y que poseen un sitio activo putativo PSY. Significativamente, la evaluación de su funcionalidad en vivo por medio de un test de complementación heteróloga, mostró que los seis miembros de la familia de genes PSY de B. napus son funcionales. En la siguiente etapa se seleccionó el gen BnaC.PSY.a-6xHis y se sobreexpresó en semilla de B. napus. En los seis eventos transgénicos estudiados, se observó nivel de transcritos del transgen y en alguno de los eventos, cambios en el patrón de transcritos de los genes BnaX.PSY y probable detección de la proteína BnaC.PSYa-6xHis en semilla (30-60 dpa). Finalmente, se determinó un incremento dos veces la concentración de carotenoides, compuesto principalmente por luteína en semillas transgénicas respecto al control, demostrando que la sobreexpresión en semilla de un gen endógeno PSY incrementó los niveles de carotenoides en B. napus. A la vez que proporciona un pool de genes PSY funcionales idóneos para su uso en ingeniería metabólica del contenido de carotenoides en cultivos oleaginosos./ABSTRACT: Phytoene synthase (PSY) has been shown to catalyze the first committed step of carotenoid biosynthesis. PSY is encoded by a single copy gene in Arabidopsis thaliana, but most plant species contain a small gene family. In Brassica napus L., the existence of a PSY family of six members that exhibit tissue-specific expression has been identified, however, the question of whether this large PSY family actually encodes six functional enzymes remained to be answered. Moreover, it has been shown in this species, that PSY activity is a rate-limiting factor in seed carotenoid biosynthesis. This limitation was demonstrated through initial work when the sole over-expression of a bacterial phytoene synthase gene in seeds raised β-carotene levels 50-fold. The use of different PSY transgene sources, however, can enhance carotenoid content to various degrees. In this context, it was important to investigate whether all six B. napus PSY genes were functional and to determine which ones could represent a better alternative to select and overexpress in B. napus seed. In this study the complete coding sequences of six B. napus PSY genes were isolated. This further confirmed that the six do encode proteins had high sequence identity and similar tridimensional structures with a putative PSY active site. Significantly, evaluating their functionality in-vivo using a heterologous complementation system showed all six B. napus PSY enzymes were functional. Six transgenic events were generated with the BnaC.PSYa-6xHis transgene. Expression of the transgene was confirmed in all events and changes in the transcript pattern of BnaX.PSY genes were detected in some events. The presence of the BnaC.PSYa-6xHis protein could not be undoubtedly detected in seed at both developmental stages evaluated (30-60 dpa). Finally, a 2- fold increase in carotenoid concentration in transgenic relative to control seeds was detected. Seed carotenoid extract consisted mainly of lutein. Altogether, these results indicated that overexpression of an endogenous gene PSY produced a modest increase of carotenoid levels in B. napus seeds. In addition, this work provides a pool of functional PSY genes suitable for metabolic engineering of seed carotenoid content.
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